GRP78在原發(fā)性開角型青光眼患者小梁細胞中表達下調的研究.pdf

1、目的：
　　 本研究通過體外培養(yǎng)人眼小梁細胞，將衣霉素(Tunicamycin)、十字孢堿(Staurosporine)分別作為內質網應激及細胞凋亡處理因素，分子生物學方法檢測內質網應激反應伴侶蛋白GRP78在體外培養(yǎng)的正常人及原發(fā)性開角型青光眼(POAG)病人眼小梁細胞內mRNA及蛋白表達水平的變化。旨在從新的角度解釋GRP78在細胞凋亡中可能發(fā)揮的作用，以及因凋亡導致的小梁細胞數目減少進而影響房水流出阻力的調節(jié)機制，為POA

2、G的發(fā)病機理的研究提供新的思路，為探討其治療措施提供新的方向。
　　 方法：
　　 1.人眼小梁細胞的體外培養(yǎng)和鑒定：
　　 1)組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)正常人小梁細胞(NTM)及POAG患者小梁細胞(GTM)
　　 2)顯微鏡觀察、免疫細胞化學等方法鑒定人眼小梁細胞；
　　 2.藥物處理小梁細胞：
　　 1)將細胞分為空白組、對照組和處理組，處理組細胞培養(yǎng)液分別添加Tunicamycin(Tm)

3、、Staurosporine(STS)、對照組添加dimethylsulfoxide(DMSO)進行細胞培養(yǎng)觀察內質網伴侶蛋白GRP78表達的改變；
　　 2)應用MTS法檢測Tm、STS對人眼小梁細胞的毒性；
　　 3.檢測人眼小梁細胞內GRP78表達的差異：
　　 1)應用Real-timePCR檢測人小梁細胞GRP78mRNA的表達；
　　 2)應用Western blot方法檢測人小梁細胞GRP7

4、8蛋白的表達；
　　 3)應用細胞免疫化學染色法通過共聚焦顯微鏡觀察GRP78蛋白與Myocilin蛋白的共定位情況。
　　 結果：
　　 1.小梁網細胞鑒定：
　　 原代正常人和POAG患者小梁網細胞均表達FN、LN、NSE、vimentin；第Ⅷ因子陰性。
　　 2.藥物處理對小梁細胞的影響：
　　 1)形態(tài)觀察：光鏡下可見POAG患者與正常人，小梁細胞形態(tài)、分布上未見明顯差別；用Tm

5、、STS藥物處理后，小梁細胞胞突減少，細胞體積縮小，密度下降，STS處理組較TM組變化明顯，DMSO處理組小梁細胞形態(tài)無明顯變化。
　　 2)MTS法檢測(細胞增殖檢測)：1μM，1μM，10μM，30μM，100μMTm或0.03μM，0.1μM，0.3μM，0.9μM，1.2μMSTS培養(yǎng)細胞24小時后，NTM與GTM增殖均受抑制，GTM受抑制更為明顯，差別具有統計學意義，P＜0.05；
　　 3.人眼小梁細胞內GR

6、P78表達的差異：Real-timePCR和Western blot顯示相似的結果：
　　 1)原代POAG患者小梁網細胞內GRP78水平明顯低于正常人，差異有統計學意義(P＜0.05)。
　　 2)Tm可增加正常人及POAG患者小梁細胞內GRP78的表達水平，但后者的增高水平明顯低于前者，差異有統計學意義(P＜0.05)。
　　 3)Tm對人小梁細胞內GRP78表達水平的影響明顯大于STS，差異有統計學意義(P

7、＜0.05)。
　　 4)GTM細胞對凋亡誘導劑STS的反應大于NTM細胞。
　　 4.共聚焦顯微鏡觀察顯示
　　 1)POAG患者小梁細胞及Tm、STS處理過的正常人小梁細胞內GRP78蛋白與Myocilin蛋白共定位，而未處理的正常人小梁細胞內GRP78蛋白與Myocilin蛋白分布有差異；
　　 2)POAG患者小梁細胞及用Tm處理過的正常人小梁細胞內GRP78出現核周聚集現象，而在正常人小梁細胞及