稻瘟病菌小型分生孢子的萌發(fā)和致病性研究.pdf

1、由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的稻瘟病是水稻上的主要真菌病害，嚴(yán)重影響著全球水稻產(chǎn)量。穗頸瘟—稻瘟病最具毀滅性的發(fā)生形式，可以在沒(méi)有大量葉斑和分生孢子產(chǎn)生的情況下迅速流行開(kāi)來(lái)，這表明分生孢子可能不是田間唯一的侵染源。由稻瘟病菌的特殊專(zhuān)化型引起的麥瘟病是小麥上的穗部病害，田間往往出現(xiàn)嚴(yán)重的穗瘟癥狀，而葉片和莖很少有病斑。因此除分生孢子外，應(yīng)該還有其他接種體負(fù)責(zé)麥瘟病的傳播和爆發(fā)。作為研究真菌與植物互作的模式菌，稻瘟

2、病菌除了產(chǎn)生分生孢子（即常見(jiàn)的洋梨形大型分生孢子）外，還可以產(chǎn)生小型分生孢子。然而大量的研究均集中在大型分生孢子上，目前尚無(wú)小型分生孢子萌發(fā)及其在侵染循環(huán)中所起作用的報(bào)道。本論文主要對(duì)稻瘟病菌小型分生孢子的液體產(chǎn)生條件、萌發(fā)能力、致病性和基因表達(dá)情況做了系統(tǒng)的研究。
　　首先，我們提供了一套獲得大量純凈小型分生孢子的方法，而且培養(yǎng)液中的小型分生孢子經(jīng)濾布和雙圈中速濾紙過(guò)濾后，變得十分純凈，沒(méi)有大型分生孢子或菌絲的污染。通過(guò)測(cè)定一系

3、列突變體的小型分生孢子產(chǎn)量，我們發(fā)現(xiàn)與野生型相比，MAP激酶突變體△pmk1及其轉(zhuǎn)錄因子突變體△mst12的產(chǎn)孢量下降了100倍，而Mst50互作蛋白突變體△mip11的小型分生孢子產(chǎn)量卻上調(diào)了4.5倍，小型分生孢子的產(chǎn)生涉及Pmk1所在的MAPK信號(hào)通路。在1％水瓊脂上培養(yǎng)72h后，4.9％的小型分生孢子產(chǎn)生芽管。無(wú)論在植物葉片還是疏水玻片上，小型分生孢子萌發(fā)均不形成附著胞。大部分己萌發(fā)的小型分生孢子不能形成菌落，可能與其芽管缺乏有絲

4、分裂有關(guān)。前人推測(cè)小型分生孢子在稻瘟病菌有性生殖中起不動(dòng)精子的作用，而我們發(fā)現(xiàn)在1％水瓊脂或燕麥培養(yǎng)基表面上，小型分生孢子的萌發(fā)和芽管的生長(zhǎng)不受另一個(gè)交配型菌株的影響，在該實(shí)驗(yàn)條件下小型分生孢子沒(méi)有不動(dòng)精子的作用，因此它應(yīng)該在稻瘟病菌其他方面有功能。
　　小型分生孢子對(duì)無(wú)傷的植物葉片喪失了致病力，這與其不能形成附著胞的事實(shí)相符合。與大型分生孢子相比，小型分生孢子內(nèi)部的能量?jī)?chǔ)備極其有限，缺乏足夠的脂質(zhì)體和糖原，難以產(chǎn)生足夠的膨壓用于

5、植物表皮的穿透。然而，小型分生孢子可以在有傷口的植物葉片、莖和開(kāi)花期的小穗上定殖并產(chǎn)生病斑。小型分生孢子萌發(fā)形成的菌落和小型分生孢子致病后病斑分離出的菌落在生長(zhǎng)、產(chǎn)孢、致病等方面均表現(xiàn)正常。液體產(chǎn)生小型分生孢子的條件，不適合有性生殖過(guò)程，更類(lèi)似于植物體內(nèi)的生長(zhǎng)條件，那么小型分生孢子極有可能在發(fā)病植物內(nèi)產(chǎn)生，尤其是維管束系統(tǒng)內(nèi)。因此，我們對(duì)實(shí)驗(yàn)室和田間發(fā)病植物的無(wú)癥狀組織進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)了小型分生孢子或小型分生孢子類(lèi)似物的存在。通過(guò)比較營(yíng)養(yǎng)

6、菌絲、大型分生孢子和小型分生孢子的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，我們鑒定到2個(gè)在小型分生孢子中特異表達(dá)的基因，6個(gè)上調(diào)表達(dá)20倍以上的基因。這些基因大部分功能未知，可能與小型分生孢子尚未明確的功能有關(guān)，因此，關(guān)注特異表達(dá)和上調(diào)表達(dá)基因，對(duì)研究小型分生孢子的功能十分重要。
　　以上結(jié)果表明小型分生孢子可以萌發(fā)，具有致病性，并可以在植物內(nèi)產(chǎn)生。由于它們體積小、數(shù)量大，植物體內(nèi)產(chǎn)生的小型分生孢子可能允許病原菌在植物維管束系統(tǒng)中自由擴(kuò)散，導(dǎo)致系統(tǒng)性定殖，這

7、可能是稻瘟病突然爆發(fā)的重要因素。本研究為防控稻瘟病、麥瘟病和其它由坐殼屬M(fèi)agnaporthe引起的病害提供重要的理論參考。
　　在研究小型分生孢子的同時(shí)，我們初步開(kāi)展了稻瘟病菌大型分生孢子的致病機(jī)理研究。缺失MAP激酶MoMps1時(shí)，病菌大型分生孢子形成附著胞后不能進(jìn)一步穿透植物表皮，喪失了致病力，同時(shí)大型分生孢子本身延遲死亡。因?yàn)楦街纬蓵r(shí)期大型分生孢子自噬性死亡是稻瘟病菌成功侵染所必需的，所以我們推測(cè)缺失MoMPS1影響了

8、自噬的進(jìn)行，導(dǎo)致大型分生孢子內(nèi)能量?jī)?chǔ)備無(wú)法轉(zhuǎn)運(yùn)至附著胞。本部分主要對(duì)MoMps1激酶與其突變體自噬表型的關(guān)系進(jìn)行初步研究。我們利用酵母雙雜技術(shù)對(duì)10個(gè)可能同時(shí)與MoMPS1及自噬相關(guān)的候選基因進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)MoMps1分別與MoAtg13、MoAtg26、MoPex1互作，并且MoAtg13與MoPex1互作。Atg13在其他真核細(xì)胞中的功能十分保守，作為Atg1激酶復(fù)合體的適配器或輔助蛋白，參與Tor1介導(dǎo)的自噬起始;MoAtg26在

9、畢赤酵母Pichia pastoris中的同源物參與過(guò)氧化物酶體自噬;MoPex1是參與過(guò)氧化物酶體生物合成的蛋白，其敲除突變體在附著胞發(fā)育時(shí)期，對(duì)脂肪滴的調(diào)動(dòng)和降解能力顯著減弱。因此，MoMps1可能通過(guò)與MoAtg13、MoPex1互作，參與大型分生孢子附著胞形成時(shí)期脂質(zhì)體的調(diào)動(dòng)和降解，缺失MoMPS1后導(dǎo)致大型分生孢子Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡有缺陷。該結(jié)果為研究MoMPS1在稻瘟病菌附著胞發(fā)育時(shí)期影響侵染釘形成的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，有助于進(jìn)