稻瘟病菌精氨酸合成途徑基因的功能分析及稻瘟病菌代謝組學(xué)的研究.pdf

1、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)作為水稻重要病害稻瘟病的病原菌，每年在全球范圍內(nèi)造成巨大的糧食損失。由于該菌的經(jīng)濟(jì)重要性以及易于遺傳操作，稻瘟病菌已逐漸變?yōu)檠芯坎≡婢c植物互作機(jī)制的模式真菌。對(duì)于植物病原菌來(lái)說(shuō)，感知營(yíng)養(yǎng)條件信號(hào)并相應(yīng)地作出代謝調(diào)整反應(yīng)對(duì)于病原菌的成功侵染至關(guān)重要。稻瘟病菌是一種半活體營(yíng)養(yǎng)真菌，在其致病侵染過(guò)程中，哪些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)自宿主植物，哪些物質(zhì)由稻瘟病菌自身合成以及特定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)稻瘟病菌致病性的影

2、響是怎么樣的，一直是稻瘟病菌研究需要解決的問(wèn)題。
　?。ㄒ唬┳罱芯勘砻鳎恍┗A(chǔ)性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如氨基酸等對(duì)于稻瘟病菌的致病性是必需的。精氨酸（Arginine，Arg）作為真核生物中最具功能的一種氨基酸，不僅在蛋白合成，而且在氮代謝平衡、一氧化氮(NO)合成、尿素循環(huán)以及應(yīng)對(duì)逆境脅迫等過(guò)程中都具有重要的作用。精氨酸合成途徑在真菌中高度保守，但是對(duì)于它在稻瘟病菌中的功能還知之甚少。因此，本文對(duì)稻瘟病菌整個(gè)精氨酸合成途徑進(jìn)行了鑒定分析，

3、并對(duì)其中三個(gè)基因（MoARG1、MoARG5，6和MoARG7）在稻瘟病菌生長(zhǎng)、形態(tài)建成及致病侵染等過(guò)程中的功能進(jìn)行了系統(tǒng)研究，主要結(jié)果如下:
　　1)參照釀酒酵母以及其它生物中精氨酸的合成途徑，通過(guò)同源比對(duì)分析，在稻瘟病菌中克隆了精氨酸合成途徑的所有催化酶基因包括:MoARG1(MGG_15868.7)、MoARG2(MGG_01507.7)、MoARG3(MGG_01102.7)、MoARG4(MGG_17278.7)、MoA

4、RG5,6(MGG_02690.7)、MoARG7(MGG_04210.7)、MoARG8(MGG_11934.7)和MoargE(MGG_01970.7)，并對(duì)這些基因的編碼蛋白開(kāi)展進(jìn)化分析，結(jié)果顯示精氨酸合成途徑在真菌中高度保守。
　　2) MoARG1、MoARG5，6和MoARG7分別參與了精氨酸合成途徑的第七步、第二、三步反應(yīng)和第五步反應(yīng)?；驘晒舛ㄎ话l(fā)現(xiàn)MoARG1定位于菌絲、分生孢子以及附著胞的細(xì)胞質(zhì)中，而MoARG

5、5，6和MoARG7均定位于細(xì)胞的線粒體上。MoARG1、MoARG5，6和MoARG7在稻瘟病菌附著胞形成階段表達(dá)量明顯提高，表明這三個(gè)基因參與了附著胞的形成過(guò)程即附著胞的形成需要精氨酸的合成。
　　3)基因敲除MoARG1、MoARG5，6和MoARG7，所得到的敲除突變體均表現(xiàn)為精氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型，其中突變體ΔMoarg7為不完全（滲漏）精氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型。它們?cè)跉馍z生長(zhǎng)、黑色素積累、分生孢子產(chǎn)生、有性生殖以及致病性等方面均

6、表現(xiàn)出嚴(yán)重缺陷且缺陷程度為ΔMoarg5,6＞ΔMoarg1＞ΔMoarg7。添加外源Arg，能夠部分彌補(bǔ)各突變體的表型缺陷。
　　4)大麥葉片穿透試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Arg-突變體附著胞的侵染穿透出現(xiàn)延遲、穿透率嚴(yán)重下降且突變體侵染菌絲生長(zhǎng)減弱并被限制在宿主細(xì)胞內(nèi)無(wú)法擴(kuò)展增殖，以上缺陷可能是導(dǎo)致Arg-突變體致病性喪失或減弱的原因。
　　5)在稻瘟病菌中利用熒光探針檢測(cè)了NO的產(chǎn)生，發(fā)現(xiàn)NO在孢子萌發(fā)及附著胞形成階段大量產(chǎn)生。另外，

7、探究了稻瘟病菌中精氨酸與NO產(chǎn)生的關(guān)系，NO在Arg-突變體中仍可以產(chǎn)生且外源補(bǔ)充NO不能恢復(fù)突變體的表型缺陷，從而表明，與動(dòng)物細(xì)胞不同，稻瘟病菌中NO的產(chǎn)生不依賴于Arg/NO途徑，還可能存在其它NO產(chǎn)生途徑。
　?。ǘ┐x組學(xué)作為一門新興的技術(shù)科學(xué)，它能夠全面檢測(cè)生物樣品中的小分子代謝物(MW＜1000)。本文以稻瘟病菌野生型菌株Guy11和細(xì)胞自噬突變體ΔMoatg1為研究菌株，以它們的菌絲、分生孢子、附著胞為研究對(duì)象，開(kāi)

8、展了各組織樣品代謝組學(xué)的研究，主要結(jié)果如下:
　　1)基于LC-MS和GC-MS兩種技術(shù)平臺(tái)，參照已有的植物、微生物代謝組學(xué)研究方法并進(jìn)行優(yōu)化，主要包括樣品制備、代謝物的提取、儀器參數(shù)程序的調(diào)整、數(shù)據(jù)處理與分析等環(huán)節(jié)，建立了一整套稻瘟病菌代謝組學(xué)研究分析方法。
　　2)與野生型Guy11相比，細(xì)胞自噬突變體ΔMoatg1菌絲、分生孢子以及附著胞中大部分的代謝物含量有所下降。這些化合物涵蓋了糖類、氨基酸、多元醇以及脂類等。附著