β3GnT8在結(jié)腸癌細胞株轉(zhuǎn)移中的分子機制及轉(zhuǎn)錄因子c-jun對β3GnT8的調(diào)控作用.pdf

1、目的：研究糖基轉(zhuǎn)移酶β3GnT8在結(jié)腸癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移中的分子機制及探討轉(zhuǎn)錄因子c-jun對β3GnT8的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。
　　方法：⑴Tranwell細胞遷移和侵襲實驗分別檢測LS-174T,SW620,SW480, LoVo四株結(jié)腸癌細胞的遷移和侵襲能力。⑵Western-blot檢測β3GnT8和CD147在四株結(jié)腸癌細胞中的蛋白表達水平。⑶流式細胞術和Lectin-blot檢測四株結(jié)腸癌細胞株中多聚乳糖胺鏈的表達水平。⑷將β3

2、GnT8的真核正義表達載體及空載體、β3GnT8干擾載體及對照載體通過脂質(zhì)體分別介導轉(zhuǎn)染至低轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌細胞株LS-174T和高轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌細胞株LoVo。⑸Western-blot檢測轉(zhuǎn)染后LS-174T中β3GnT8上調(diào)后和LoVo細胞中β3GnT8下調(diào)后CD147糖基化的改變。⑹Tranwell細胞遷移和侵襲實驗檢測轉(zhuǎn)染后LS-174T中β3GnT8上調(diào)后和LoVo中β3GnT8下調(diào)后,其細胞遷移和侵襲能力的變化。⑺克隆轉(zhuǎn)錄因子c

3、-jun全長基因序列并構(gòu)建c-jun正義表達載體。⑻將c-jun真核正義表達載體及空載體通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染胃癌SGC-7901細胞,并通過G418篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株。⑼熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染熒光載體的細胞株,RT-PCR和Western-blot檢測c-jun、β3GnT8和CD147的mRNA和蛋白表達;流式細胞術及Lectin-blot檢測c-jun對細胞糖蛋白中多聚乳糖胺鏈的表達影響;細胞增殖和細胞周期實驗檢測轉(zhuǎn)染c-jun后細胞增殖能力的變

4、化。
　　結(jié)果：①Transwell小室檢測四株結(jié)腸癌細胞株中侵襲和遷移能力發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌細胞株的轉(zhuǎn)移能力從低到高依次為LS-174T,SW620,SW480,LoVo。②Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)隨著結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移程度的增加,β3GnT8和HG-CD147的表達也隨之升高,且β3GnT8和HG-CD147的表達具有一定的相關性。③流式細胞術和Lectin-blot實驗結(jié)果顯示,多聚乳糖胺鏈的表達也隨著結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移程度的增加而升高,并

5、且被多聚乳糖胺鏈修飾的CD147糖蛋白的分子量大小在49 kDa-90 kDa之間。④LS-174T中β3GnT8上調(diào)后,與空白對照組相比, HG-CD147的糖基化表達升高,其侵襲和遷移能力也增強;LoVo細胞中β3GnT8下調(diào)后,與空白對照組相比,HG-CD147的糖基化表達下降,其侵襲和遷移能力也降低。⑤構(gòu)建c-jun正義表達載體,正反向測序結(jié)果在NCBI基因庫中BLAST同源檢索后顯示正義載體中插入的c-jun目的片段正確。⑥通

6、過熒光顯微鏡觀察、RT-PCR、western-blot等檢測,c-jun正義表達載體成功轉(zhuǎn)入細胞并得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株SGC-7901。⑦Western-blot檢測發(fā)現(xiàn),c-jun基因上調(diào)后,與對照組相比β3GnT8和HG-CD147的表達均升高。(8)細胞增殖和細胞周期實驗檢測發(fā)現(xiàn),c-jun基因上調(diào)后,與對照組相比細胞增殖能力增強。
　　結(jié)論：⑵四株結(jié)腸癌細胞株的轉(zhuǎn)移能力從低到高依次為LS-174T,SW620, SW480