維生素D3抑制Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3依賴的結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的研究.pdf

1、背景:結(jié)直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，在我國，發(fā)病率呈逐年上升趨勢，目前居惡性腫瘤發(fā)病率第四位，預(yù)計在我國結(jié)直腸癌發(fā)病率上升的趨勢還將進(jìn)一步發(fā)展。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，維生素D在預(yù)防和減少結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率中發(fā)揮重要的作用。作為一種潛在的抗腫瘤藥物，維生素D3具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。因此，深刻理解維生素D3的抗腫瘤作用機(jī)制對臨床的有效應(yīng)用尤為重要。研究表明，通過下調(diào)TGF-β信號通路而抑制細(xì)胞生長和誘導(dǎo)凋亡是維生素D3抗腫瘤增殖的重要作

2、用機(jī)制。而Runx3蛋白是TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游的關(guān)鍵因子,Runx3蛋白的失活使得TGF-β信號通路發(fā)生紊亂，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。其中，Runx3是Runt 結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子(Runx1、Runx2和Runx3)家族成員之一，是一種新型的抑癌基因；在胃癌、食道癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌等中都發(fā)現(xiàn)有不同程度的轉(zhuǎn)錄失活或表達(dá)下調(diào)。研究表明，結(jié)腸癌組織中Runx3表達(dá)明顯低于正常組織，恢復(fù)結(jié)腸癌細(xì)胞中Runx3的活性，可以抑制腫瘤細(xì)胞的生

3、長和轉(zhuǎn)移。鑒于共同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，維生素D3的抗腫瘤作用機(jī)制是否與Runx3的表達(dá)有關(guān)尚無研究報道。而且，已有研究證實，維生素D3對 Runt家族所有轉(zhuǎn)錄因子都有調(diào)控作用，可以激活髓細(xì)胞中Runx1和HL-60白血病細(xì)胞中Runx3的表達(dá)，抑制成骨細(xì)胞中Runx2的表達(dá)。那么，在結(jié)腸癌細(xì)胞中維生素D3是否對Runx3的表達(dá)有誘導(dǎo)作用？因此，本課題將對維生素D3對結(jié)腸癌細(xì)胞中Runx3的表達(dá)影響及其機(jī)制進(jìn)行探討。
　　 目的:

4、r>　　 1、明確維生素D3的抗結(jié)腸癌細(xì)胞增殖作用與上調(diào)Runx3的表達(dá)是否相關(guān)；
　　 2、探討維生素D3上調(diào)Runx3表達(dá)的可能機(jī)制。
　　 方法:
　　 1、利用western blot檢測結(jié)腸癌細(xì)胞系中Runx3的表達(dá)；
　　 2、利用RT-PCR和western blot分別檢測不同濃度的維生素D3作用及相同濃度的維生素D3作用不同時間段后結(jié)腸癌細(xì)胞中Runx3 mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化；

5、
　　 3、基因重組的方法構(gòu)建含有Runx3特異性siRNA的表達(dá)載體；
　　 4、siRNA轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞SW480，經(jīng)G418篩選獲得穩(wěn)定低表達(dá)的細(xì)胞系；
　　 5、MTT法和流式細(xì)胞術(shù)檢測維生素D3對轉(zhuǎn)染前后的細(xì)胞生長作用的影響；
　　 6、Western blot檢測cyclin A，cyclin D1，cyclin E，cdk2，cdk4，PCNA，Rb and p27蛋白水平的表達(dá)變化。

6、>　　 結(jié)果:
　　 1、結(jié)腸癌細(xì)胞中Runx3的表達(dá)情況對結(jié)腸癌細(xì)胞系Runx3的表達(dá)進(jìn)行western blot檢測結(jié)果顯示：Lovo細(xì)胞Runx3表達(dá)缺失；HT-29、SW620細(xì)胞系中Runx3有微弱表達(dá)。SW480細(xì)胞系Runx3表達(dá)水平相對較高。
　　 2、維生素D3誘導(dǎo)SW480細(xì)胞Runx3基因表達(dá)的時間和劑量依賴性增加利用RT-PCR技術(shù)檢測經(jīng)不同濃度維生素D3作用后SW480結(jié)腸癌細(xì)胞中Runx3基

7、因mRNA表達(dá)水平的變化，發(fā)現(xiàn)未經(jīng)藥物處理的細(xì)胞中Runx3基因低表達(dá)，分別用10-10、10-9、10-8、10-7 mol/L的維生素D3作用后，細(xì)胞中Runx3 mRNA的表達(dá)量逐漸增加，具有明顯的劑量依賴性。Western blot結(jié)果顯示細(xì)胞中Runx3在蛋白表達(dá)水平也呈劑量依賴性增加，與RT-PCR結(jié)果一致。其中，維生素D3的作用濃度為10-8mol/L時，Runx3的表達(dá)已明顯增加，我們以此濃度進(jìn)行后續(xù)實驗。
　　

8、 10-8mol/L的維生素D3作用于SW480結(jié)腸癌細(xì)胞，western blot檢測作用不同時間后(6 h、12 h、24 h、48 h、72 h)Runx3蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，隨著維生素D3作用時間的推移，Runx3蛋白的表達(dá)量逐漸增加，其中在72h達(dá)高峰。
　　 3、維生素D3通過誘導(dǎo)Runx3表達(dá)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖成功構(gòu)建了含有Runx3 特異性siRNA的表達(dá)質(zhì)粒Runx3-si。選取結(jié)腸癌細(xì)胞SW480(表達(dá)

9、中等強(qiáng)度Runx3)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。經(jīng)G418抗性篩選，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的結(jié)腸癌細(xì)胞系：SW480-siRNA和SW480-vector。RT-PCR和western blot檢測驗證，Runx3-si轉(zhuǎn)染細(xì)胞后能顯著抑制Runx3的表達(dá)。轉(zhuǎn)染空載體對Runx3的表達(dá)無影響，進(jìn)而獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的敲除Runx3的結(jié)腸癌細(xì)胞系。
　　 細(xì)胞生長曲線結(jié)果顯示，維生素D3作用后，SW480-siRNA細(xì)胞的生長速度顯著快于對照組SW480-vect

10、or和SW480細(xì)胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05),而對對照組SW480-vector和SW480細(xì)胞的生長抑制作用無統(tǒng)計學(xué)差異。Runx3基因敲除后，維生素D3的抑制作用不明顯，SW480-siRNA加藥前后生長速度無明顯差異。流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，抑制Runx3基因表達(dá)后，維生素D3的抑制增殖作用減弱，細(xì)胞生長數(shù)明顯增多、速度加快，G1期比例顯著減少(p＜0.05)。
　　 4、Runx3可以通過調(diào)節(jié)cyclin A，

11、cyclin D1，cyclin E，cdk2，cdk4，PCNA，Rb和p27等周期相關(guān)分子的表達(dá)影響細(xì)胞周期進(jìn)展western blot結(jié)果顯示，Runx3 特異性siRNA能上調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞中cyclin A，cyclin D1,cyclin E,cdk2,cdk4和PCNA蛋白的表達(dá)，而下調(diào)Rb和p27蛋白的表達(dá)。維生素D3對細(xì)胞周期蛋白的影響為：抑制cyclin A,cyclin D1,cyclin E，cdk2，cdk4和PC

12、NA的表達(dá)，而刺激Rb和p27蛋白的表達(dá)。然而，維生素D3對Runx3基因敲除細(xì)胞中的細(xì)胞相關(guān)分子的表達(dá)影響較小。
　　 結(jié)論:
　　 本研究揭示了維生素D3通過誘導(dǎo)抑癌基因 Runx3的表達(dá)上調(diào)而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的證據(jù)，同時，我們發(fā)現(xiàn)Runx3 特異性siRNA能上調(diào)cyclin A，cyclin D1,cyclin E,cdk2,cdk4，p-Rb和PCNA蛋白的表達(dá)，而下調(diào)Rb和p27蛋白的表達(dá)，從而影響細(xì)胞周期