Klotho基因在結(jié)腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)調(diào)控及對細(xì)胞生長影響的研究.pdf

1、目的:通過細(xì)胞學(xué)研究探索Klotho在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)與其啟動子DNA甲基化狀況的關(guān)系,明確其對結(jié)腸癌細(xì)胞株生長的影響,初步探索Klotho基因與結(jié)腸癌之間潛在的關(guān)系。
　　 方法和材料:采用RT-PCT技術(shù)檢測Klotho在結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116、HT29、DLD1、LS180、SW480和SW620中的表達(dá),用甲基化特異性PCR(MSP)檢測Klotho在上述結(jié)腸癌細(xì)胞株中的DNA甲基化水平。用去甲基化藥物5-氮雜-2'

2、-脫氧胞苷(5-Aza-dC)處理結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116、HT29、LS180和SW620,并檢測Klotho表達(dá)狀況。通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染和篩選,觀察Klotho對結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116和HT29克隆形成的影響。用MTS方法檢測Klotho過表達(dá)對結(jié)腸癌細(xì)胞HT29生長繁殖的影響。
　　 結(jié)果:Klotho在結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116和HT29中表達(dá)沉默,在DLD1,LS180和SW620細(xì)胞中表達(dá)顯著下調(diào),在正常結(jié)腸組織中有高表達(dá)。

3、MSP/USP顯示Klotho啟動子在結(jié)腸癌細(xì)胞株DLD1,HCT116,HT29,LS180和SW620中完全或部分甲基化。去甲基化藥物5-氮雜-2'-脫氧胞苷處理結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116、HT29、LS180和SW620后,Klotho恢復(fù)表達(dá)或表達(dá)顯著增加。說明Klotho在結(jié)腸癌細(xì)胞中表達(dá)“沉默”或顯著下調(diào)與啟動子DNA高甲基化有關(guān)。通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Klotho后結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116和HT29克隆形成數(shù)較轉(zhuǎn)染空載體的

4、對照組減少,克隆體積減小。MTS檢測發(fā)現(xiàn)當(dāng)原始鋪板濃度是2000個(gè)/孔時(shí),第1天,第3天和第5天pcDNA3.1組HCT29細(xì)胞吸光度分別是0.6680±0.0234,1.4394±0.0597,1.6968±0.0251,Klotho組HCT29細(xì)胞吸光度分別是0.5814±0.0118,0.9760±0.0622,1.6264±0.0205,即Klotho組細(xì)胞密度明顯小于pcDNA3.1組,兩者之間存在顯著性差異(p＜0.01)。

5、當(dāng)原始鋪板濃度是4000個(gè)/孔時(shí),第1天,第3天pcDNA3.1組HCT29細(xì)胞吸光度分別是O.9512±0.0319,1.7370±0.0330,Klotho組HCT29細(xì)胞吸光度分別是0.7534±0.0165,1.5352±0.1370,Klotho組細(xì)胞密度明顯小于pcDNA3.1組,兩者之間存在顯著性差異(p＜0.05)。第5天pcDNA3.1組吸光度為1.7098±0.0252,Klotho組為1.7228±0.0224,兩