HGF促動(dòng)脈血管形成的機(jī)理研究.pdf

1、目的:
　　 (1)確定Ad-HGF感染人股動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HFAECs)的最佳感染強(qiáng)度,初步探討肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)對(duì)HFAECs的Notch1和D114基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)作用,為進(jìn)一步探討HGF與Noth信號(hào)通路的關(guān)系奠定基礎(chǔ)；
　　 (2)探討HGF對(duì)HFAECs的D114-Notch-Hey2信號(hào)通路的激活作用,及此通路激活后對(duì)HFAECs增殖和遷移能力的影響,從血管新生的角度來(lái)闡明Notch信號(hào)調(diào)控HGF促動(dòng)脈形

2、成的作用及機(jī)制。
　　 (3)體外分離培養(yǎng)及鑒定人內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs),為下一步從血管發(fā)生的角度探討HGF是否通過(guò)Notch信號(hào)通路調(diào)控祖細(xì)胞的分化來(lái)促動(dòng)脈形成的機(jī)理提供體外細(xì)胞模型。
　　 方法:
　　 第一部分體外培養(yǎng)HFAECs,并用不同感染強(qiáng)度(MOI)(50,100,150,200,250,300pfu/cell)的攜帶綠色熒光蛋白基因的重組腺病毒(Ad-GFP)轉(zhuǎn)染HFAECs,通過(guò)流式細(xì)胞儀(檢測(cè)

3、轉(zhuǎn)染效率)和MTT法(檢測(cè)細(xì)胞損傷程度)篩選和確定最佳MOI(高轉(zhuǎn)染效率且對(duì)細(xì)胞低損傷),作為下一步攜帶HGF基因的重組腺病毒(Ad-HGF)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的最優(yōu)條件。Ad-HGF以最佳的MOI轉(zhuǎn)染HFAECs48h后,收集細(xì)胞上清,用ELISA法檢測(cè)HGF蛋白的表達(dá)水平,選取HGF表達(dá)水平最佳的細(xì)胞提取總RNA,通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)來(lái)檢測(cè)Notch1和D114基因的轉(zhuǎn)錄水平。以轉(zhuǎn)染Ad-GFP的細(xì)胞作為對(duì)照。
　　 第二

4、部分基于前期研究,Ad-HGF以最佳MOI(200 pfu/cell)轉(zhuǎn)染HFAECs后0h、24h、48h、72h,分別收集細(xì)胞上清,用ELISA法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)HGF蛋白的表達(dá)水平；同時(shí)收集細(xì)胞提取總RNA,通過(guò)RT-PCR檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)HFAECs中Notch1、D114和Hey2基因的轉(zhuǎn)錄水平；并采用MTT法和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)分別觀察HFAECs增殖和遷移能力的變化及與D114-Notch-Hey2信號(hào)通路激活的關(guān)系；

5、均以轉(zhuǎn)染Ad-GFP的細(xì)胞作對(duì)照。
　　 第三部分無(wú)菌、肝素抗凝,取臍血(蘭州軍區(qū)總醫(yī)院婦產(chǎn)科提供,產(chǎn)婦均知情同意)作為EPCs的標(biāo)本來(lái)源。用PBS等倍稀釋后取7 mL,臍血緩慢加入裝有3mL淋巴細(xì)胞分離液的離心管中,2000r/min離心25min,取云霧狀灰白色層單個(gè)核細(xì)胞。將細(xì)胞接種在人纖維粘連蛋白包被的6孔板中,培養(yǎng)于M-199培養(yǎng)基中。觀察貼壁細(xì)胞的形態(tài)變化；采用免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定EPCs。
　　 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用

6、SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　 結(jié)果:
　　 (1)以高轉(zhuǎn)染效率且對(duì)細(xì)胞低損傷為標(biāo)準(zhǔn),確定最佳MOI為200pfu/cell；ELISA法檢測(cè)HGF表達(dá)水平的結(jié)果顯示,Ad-GFP組:(3.672±0.810)ng/ml；Ad-HGF組:(86.318±3.864)ng/ml。兩組比較轉(zhuǎn)染后48 h的HGF表達(dá)水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；
　　 (2)Ad-HGF轉(zhuǎn)染HFAECs48 h后,RT-

7、PCR結(jié)果顯示,通過(guò)紫外凝膠分析儀,可觀察到Ad-HGF組的Notch1和D114基因轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)；應(yīng)用凝膠成像分析系統(tǒng)分析凝膠成像圖中目的基因的相對(duì)強(qiáng)度,結(jié)果顯示:Ad-GFP組和Ad-HGF組的數(shù)據(jù)分別為:D114,0.788±0.021和0.936±0.018；Notch1,0和0.458±0.023,兩組間進(jìn)行單側(cè)t檢驗(yàn)分析,P<0.05,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Ad-HGF組目的基因的相對(duì)強(qiáng)度明顯高于Ad-GFP組；
　　

8、(3)Ad-HGF轉(zhuǎn)染HFAECs不同時(shí)間段后,ELISA檢測(cè)HGF表達(dá)水平的結(jié)果顯示:Ad-HGF有效的導(dǎo)入了細(xì)胞,且HGF表達(dá)水平48 h內(nèi)有時(shí)間依賴性,72h開(kāi)始下降；
　　 (4)Ad-HGF轉(zhuǎn)染HFAECs不同時(shí)間段后,RT-PCR的結(jié)果顯示:通過(guò)紫外凝膠分析儀,發(fā)現(xiàn)在0h僅能檢測(cè)到D114,基因的轉(zhuǎn)錄,在48 h內(nèi)Notch1和D114基因轉(zhuǎn)錄有時(shí)間依賴性,72h時(shí)Notch1基因轉(zhuǎn)錄已檢測(cè)不到,D114基因轉(zhuǎn)錄也明

9、顯減弱。Hey2的轉(zhuǎn)錄水平的變化與Notch1相一致。凝膠成像分析系統(tǒng)軟件處理結(jié)果與上述觀察結(jié)果一致；
　　 (5)在轉(zhuǎn)染Ad-HGF不同時(shí)間段的HFAECs的MTT試驗(yàn)中初步觀察到,與對(duì)照組相比,在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)Ad-HGF組的HFAECs的增殖和存活能力明顯增強(qiáng)；Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,遷移介質(zhì)中不含HGF時(shí),兩組細(xì)胞的遷移能力在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)差異不明顯(p>0.05)；遷移介質(zhì)中含HGF時(shí),在24h、48h Ad-HG

10、F組細(xì)胞的遷移能力明顯強(qiáng)于對(duì)照組(p<0.05),且遷移能力在48h強(qiáng)于在24h但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)；
　　 (6)EPCs體外培養(yǎng)形態(tài)觀察結(jié)果:細(xì)胞呈梭形,隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)呈“鋪路石”樣,與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道相一致；
　　 (7)免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定EPCs的結(jié)果顯示:分離培養(yǎng)的細(xì)胞VEGFR-2和CD133均呈陽(yáng)性反應(yīng),CD34反應(yīng)較弱。
　　 結(jié)論:
　　 (1)HGF對(duì)HFAECs的Notch1