乙酰肝素酶在卵巢癌中的表達及與其血管生成、預后的關系.pdf

1、腫瘤細胞要實現(xiàn)其擴散、轉(zhuǎn)移，必須首先穿越由細胞外基質(zhì)(ECM)和基底膜(BM)組成的屏障。該屏障主要由兩種成分構(gòu)成：一是結(jié)構(gòu)蛋白；二是糖氨聚糖，其主要成分是硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparinsulphateproteoglycan，HSPG)。乙酰肝素酶(heparanse，Hpa)是一種蛋白聚糖類碳水化合物，是基底膜的主要構(gòu)成成分，它能與細胞表面及ECM中的活性分子結(jié)合，粘附于細胞表面，是ECM聚集和穩(wěn)定的基礎。同時，Hpa是體內(nèi)唯

2、一能夠降解HSPG的內(nèi)切酶，通過降解腫瘤細胞外基質(zhì)、基底膜和促進新生血管形成來加速腫瘤的擴散和轉(zhuǎn)移。Hpa主要通過直接、間接兩種方式發(fā)揮促血管生成作用：①直接作用，Hpa可直接作用于內(nèi)皮細胞以生芽方式促進血管生成；②間接作用，通過血管內(nèi)皮細胞釋放乙酰硫酸肝素鹽-堿性成纖維細胞生長因子(HS-bFGF)復合物和產(chǎn)生HS降解片段以促進bFGF活性來間接誘發(fā)血管生成反應。bFGF是一種強有力的促血管生成劑，對腫瘤間質(zhì)血管新生和侵襲起有重要作用

3、。 目前國內(nèi)外關于卵巢癌中Hpa的表達情況與其血管生成及臨床預后的研究很少，為此，本實驗采用原位雜交及免疫組化技術，研究了Hpa在卵巢癌中的表達及其與卵巢癌中微血管密度(Microvesseldensity，MVD)、bFGF蛋白表達的相關性，結(jié)合卵巢癌的臨床病理特征，初步探討卵巢癌中Hpa及其與其血管生成、預后的關系。為尋找卵巢癌新的診斷和治療途徑提供實驗資料。 第一部分：乙酰肝素酶mRNA及蛋白在卵巢癌中的表達

4、 一、材料與方法 1.標本來源 選取2003年1月-2005年11月在第三軍醫(yī)大學附屬西南醫(yī)院、新橋醫(yī)院、大坪醫(yī)院手術切除的卵巢癌組織標本41例(部分為卵巢癌標本蠟塊)，其中漿液性囊腺癌22例、粘液性囊腺癌10例，其他9例。所有病例均經(jīng)病理學確診，手術前均未接受過化療及放療。選取同期正常卵巢組織(取自卵巢漿液性囊腫周邊的正常卵巢組織)10例作為正常對照。選取第三軍醫(yī)大學附屬大坪醫(yī)院一例惡性黑色素瘤(膽囊)組織作為陽性對

5、照。 2.實驗指標及方法 2.1.原位雜交法檢測卵巢癌中HpamRNA的表達。 2.2.免疫組化S-P法檢測同一標本連續(xù)切片中Hpa蛋白的表達和10例正常卵巢組織中Hpa蛋白的表達。 3.統(tǒng)計學處理：應用x2檢驗、方差分析和t檢驗。 二、結(jié)果 1.HpamRNA的表達結(jié)果顯示，棕黃色的陽性顆粒主要在癌細胞的胞漿內(nèi)。 2.正常卵巢組織中Hpa蛋白在血管內(nèi)皮細胞的胞漿中表達。卵巢癌組織

6、中Hpa蛋白主要表達在癌細胞的胞漿內(nèi)，在癌巢周圍的血管內(nèi)皮細胞偶有表達。 3.41例卵巢癌中Hpa蛋白陽性33例，陰性8例，陽性率為80.48％。在10例正常卵巢組織中1例呈陽性表達，陽性率為10.00％。Hpa在卵巢癌和正常卵巢組織中的表達有顯著性差異(P＜0.05)。 4.晚期卵巢癌(Ⅲ-Ⅳ期)中Hpa蛋白表達率及表達強度高于早期卵巢癌(Ⅰ-Ⅱ期)(P＜0.01)；低分化組中Hpa蛋白表達率及表達強度高于高-中分化組

7、(P＜0.05)；不同組織學類型及年齡組中Hpa蛋白表達無顯著性差異(P＞0.05)。 三、討論 Hpa是人體內(nèi)唯一能夠降解HSPG的內(nèi)切酶，在腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移及血管生成等過程中起著極其重要的作用，是腫瘤細胞擴散與轉(zhuǎn)移過程中的一個關鍵酶。在人類多種惡性腫瘤中均可檢測到Hpa的表達，但其表達率可能有所不同。本實驗結(jié)果顯示，HpamRNA與Hpa蛋白的表達具有一致性，棕黃色的陽性顆粒主要在癌細胞的胞漿內(nèi)；正常卵巢組織中H

8、pa蛋白陽性率為10.00％，卵巢癌中Hpa蛋白表達陽性率為80.48％，Hpa在卵巢癌組織中的表達高于正常卵巢；本實驗結(jié)合臨床病理參數(shù)對Hpa蛋白在卵巢癌中的表達特性進行了分析，發(fā)現(xiàn)晚期以及低分化的卵巢癌中Hpa蛋白表達率及強度分別高于早期和高-中分化的卵巢癌，提示Hpa在促進腫瘤的擴散和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。 第二部分：乙酰肝素酶與卵巢癌血管生成的關系 一、材料與方法 1.標本來源：同第一部分。 2.實

9、驗指標及方法： 2.1.采用免疫組化S-P法，CD34標記血管內(nèi)皮細胞，計數(shù)MVD。 2.2.采用免疫組化S-P法，檢測卵巢癌中bFGF蛋白的表達。 3.統(tǒng)計學處理：采用t檢驗、方差分析和相關性分析。 二、結(jié)果 1.CD34標記血管內(nèi)皮細胞，著色位于血管內(nèi)皮細胞，呈現(xiàn)棕色或棕黃色顆粒。41例卵巢癌組織中MVD計數(shù)11～236，平均值為65.20±63.59。 2.卵巢癌組織中Hpa蛋白的表

10、達與MVD成正相關r=0.351(P＜0.05)。 3.晚期和低分化癌組中的MVD值分別高于早期和高-中分化癌組(P＜0.05)。 4.卵巢癌組織中bFGF陽性28例(28/41)，bFGF陽性部位主要在腫瘤細胞胞漿中，bFGF陽性表達組MVD值高于bFGF陰性表達組MVD值(77.01±67.43vs39.76±47.17)(P＜0.05)。 5.卵巢癌組織中Hpa表達和bFGF表達呈正相關r=0.420(P＜

11、0.05)。 6.41例卵巢癌組織中Hpa、bFGF共陽性表達25例。共陽性表達組的MVD值高于其他組的MVD值(82.05±69.43vs38.87±43.10)(P＜0.05)。 三、討論 惡性腫瘤的無限制侵襲性生長及其轉(zhuǎn)移依賴于血管生成，目前研究表明Hpa的高表達可以明顯促進腫瘤組織的血管生成能力，并且認為Hpa通過直接、間接兩種方式發(fā)揮促血管生成作用：①直接作用，Hpa可直接作用于內(nèi)皮細胞以生芽方式促進血

12、管生成；②間接作用，通過血管內(nèi)皮細胞釋放HS-bFGF復合物和產(chǎn)生HS降解片段以促進bFGF活性來間接誘發(fā)血管生成反應。我們的研究結(jié)果顯示：33例Hpa蛋白表達陽性的卵巢癌病例中Hpa與MVD成正相關，表明Hpa在卵巢癌中的表達增高，能夠促進卵巢癌的血管生成能力；Hpa表達和bFGF表達呈正相關，Hpa、bFGF二者均陽性表達組的MVD值高于其他組的MVD值，表明Hpa有可能通過釋放和激活bFGF來促進卵巢癌的血管生成，且二者對腫瘤的血

13、管生成起著協(xié)同的作用。 第三部分：乙酰肝素酶與卵巢癌預后的關系 一、材料與方法 1.標本來源：同第一部分。 2.實驗指標及方法： 2.1.免疫組化檢測，方法及結(jié)果同第一、二部分。 2.2.臨床隨訪。 3.統(tǒng)計學處理：采用Kaplan-Meier法，log-rank法。 二、結(jié)果 收集病例41例均經(jīng)電話隨訪，其中4例失訪。年齡29-73歲，平均50±10歲。隨訪時間截

14、止到2005年12月，平均生存時間為389.73±218.11天，最長隨訪時間為1081天，最短90天。采用Kaplan-Meier法計算平均生存時間，Hpa表達陽性組的平均生存時間為583.97±77.19天，Hpa表達陰性組為682.33±100.97天，二者比較無顯著性差異(P=0.171)。 三、討論 在人類多種惡性腫瘤中均可檢測到Hpa的表達，并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Hpa是膀胱癌、胰腺癌和胃癌的重要預后因素，Hpa是否可

15、以作為卵巢癌的獨立預后因素呢?我們對41例卵巢癌病例進行了隨訪(其中4例失訪)，Kaplan-Meier法計算平均生存時間，Hpa表達陽性組的平均生存時間為583.97±77.19天，Hpa表達陰性組為682.33±100.97天，二者比較無顯著性差異，該結(jié)果可能與研究例數(shù)少，隨訪時間短有關系。從Kaplan-Meier生存曲線可以看到隨著隨訪時間的延長Hpa表達陽性組的生存曲線較Hpa表達陰性組有更明顯的下降趨勢，如果增加樣本量、延長

16、隨訪時間，有可能發(fā)現(xiàn)Hpa表達陽性組的生存時間低于：Hpa表達陰性組。 結(jié)論： 1.采用原位雜交及免疫組化技術，發(fā)現(xiàn)Hpa在卵巢癌中表達增高，晚期以及低分化的卵巢癌中的Hpa蛋白陽性表達率及表達強度分別高于早期和高-中分化的卵巢癌組織，提示Hpa在促進腫瘤穿透細胞外基質(zhì)和基底膜結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)腫瘤的擴散和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。 2.卵巢癌病例中Hpa蛋白的表達與MVD成正相關；Hpa表達和bFGF表達呈正相關；Hpa、b