缺氧在卵巢癌血管生成擬態(tài)形成中的作用研究.pdf

1、卵巢癌是女性生殖器官三大惡性腫瘤之一，死亡率居婦科惡性腫瘤首位，預后差。血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry VM)是大多數(shù)高度惡性腫瘤組織內(nèi)普遍存在的一種功能性微循環(huán)形式，指具有可塑性的腫瘤細胞在沒有內(nèi)皮細胞參與的情況下，通過基質(zhì)重塑和自身變形形成的微循環(huán)管道。血管生成擬態(tài)的存在也使傳統(tǒng)的腫瘤抗血管治療難以徹底阻斷腫瘤血供，無法有效改善患者的生存率。VM是是腫瘤可塑性的一種表現(xiàn)，目前關(guān)于其誘導腫瘤細胞可塑性出現(xiàn)的分子

2、機制仍不清楚。缺氧是腫瘤血管生成的主要誘導因素，且缺氧微環(huán)境普遍存在于快速增殖的實性腫瘤內(nèi)，因而我們考慮缺氧也極可能是誘導腫瘤細胞可塑性，形成VM的重要因素之一。
　　目的：
　　本研究旨在探討缺氧微環(huán)境在腫瘤血管生成擬態(tài)形成中的作用，及缺氧促進腫瘤細胞形成VM的可能的分子機制。探究缺氧微環(huán)境下腫瘤細胞形成VM的分子機制有助于完善和發(fā)展VM理論；這對豐富腫瘤血管生成理論的研究具有重要意義，同時對臨床抗腫瘤治療提供了靶點。

3、r>　　方法：
　　1)首先對前期實驗中收集的來自天津醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院71例經(jīng)手術(shù)切除且隨訪資料完整的卵巢癌臨床標本進行HIF-1α、EMT表征蛋白E-cadherin、vimentin及EMT調(diào)控蛋白Twistl、Snail、slug及血管內(nèi)皮相關(guān)蛋白VE-cadherin、FLT-1、FLK-1的免疫組織化學染色。重點觀察HIF-1α與E-cadherin、vimentin及VM在同一例卵巢癌標本的連續(xù)性組織切片上的表達定

4、位之間的關(guān)系。
　　2)構(gòu)建體外三維培養(yǎng)模型，觀察是否缺氧微環(huán)境促進了VM的形成。細胞功能學實驗方法探究缺氧與腫瘤細胞的遷移、侵襲和三維管道化形成能力之間的關(guān)系。
　　3)應(yīng)用RT-PCR、Western Blot、免疫熒光實驗從蛋白和mRNA水平檢測E-cadherin，vimentin在缺氧與常氧環(huán)境下的表達情況，探究是否缺氧誘導腫瘤細胞發(fā)生了EMT，從而促進VM的形成。
　　4)Western Blot檢測VM形

5、成關(guān)鍵蛋白VE-cadherin在常氧環(huán)境和缺氧環(huán)境下表達的差異。
　　5)明膠酶譜法分析缺氧對基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9活性的影響。
　　結(jié)果：
　　1)HIF-1α蛋白與血管生成擬態(tài)的形成有關(guān)71例卵巢癌中HIF-1α的陽性表達率為39.44％(28/71)。VM陽性組HIF-1α的陽性表達率為61.11％(11/18)；VM陰性組HIF-1α的陽性表達率為32.08％(17/53)。HIF-1α在VM陰

6、性組和VM陽性組陽性表達率的差別具有統(tǒng)計學意義。HIF-1α蛋白定位于卵巢癌細胞的胞核內(nèi)，呈棕黃色顆粒。HIF-1α陽性細胞簇在腫瘤浸潤邊緣、壞死區(qū)及新生血管的周圍最為密集。
　　2)體外三維培養(yǎng)證實缺氧促進了卵巢癌細胞血管生成擬態(tài)的形成，并增強了卵巢癌細胞的侵襲和遷移能力。
　　Matrigel三維培養(yǎng)模型上發(fā)現(xiàn)與常氧組相比，缺氧組卵巢癌細胞形成VM的時間較早，結(jié)構(gòu)較復雜。OVCAR3主要形成管狀型血管生成擬態(tài)，SKOV3

7、主要形成基質(zhì)型血管生成擬態(tài)。Transwell小室體外侵襲實驗發(fā)現(xiàn)給予CoCl2缺氧處理24小時后，與常氧組相比，缺氧組穿膜細胞數(shù)增多，統(tǒng)計結(jié)果顯示差別具有統(tǒng)計學意義。遷移實驗發(fā)現(xiàn)給予CoCl2缺氧處理24小時后，與常氧組相比，缺氧組遷移細胞數(shù)較多，差別具有統(tǒng)計學意義。缺氧處理48小時后卵巢癌SKOV3和OVCAR3細胞MMP-2活性比常氧狀態(tài)高，進一步證明缺氧情況下卵巢癌的侵襲性增強。
　　3)缺氧誘導EMT發(fā)生，是血管生成擬態(tài)

8、形成的內(nèi)在機制在同一例標本的連續(xù)性組織切片上分析VM陽性組與陰性組中HIF-1α與E-cadherin，vimentin的表達定位之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在61％(11/18)VM陽性組HIF-1α高表達時，vimentin也同時高表達，而E-cadherin低表達。而VM陰性組不存在這種對應(yīng)關(guān)系，即在VM陰性組HIF-1α高表達時，沒發(fā)現(xiàn)這種對應(yīng)關(guān)系的存在。且Twistl、slug蛋白在VM陰性組和VM陽性組陽性表達率間的差別具有統(tǒng)計學意義，

9、VM陽性組表達較高。表明缺氧、EMT及VM三者間存在密切關(guān)系。
　　體外實驗證實SKOV3、OVCAR3細胞在CoCl2缺氧48小時細胞均出現(xiàn)明顯EMT樣形態(tài)變化，轉(zhuǎn)變成纖維母細胞樣形態(tài)，出現(xiàn)多角偽足，細胞之間的粘附性降低，細胞核呈現(xiàn)團塊狀或固縮狀結(jié)構(gòu)。
　　細胞免疫熒光、Westernblot及RF-PCR檢測常氧環(huán)境下和缺氧環(huán)境下細胞的蛋白和mRNA表達證實缺氧環(huán)境下卵巢癌細胞SKOV3、OVCAR3中vimentin蛋

10、白及mRNA水平均上調(diào)表達，E-cadherin表達顯著下調(diào)。以上結(jié)果進一步證實缺氧微環(huán)境下卵巢癌細胞通過發(fā)，EMT樣可塑性轉(zhuǎn)變，促進了血管生成擬態(tài)的形成。
　　4)VM形成的關(guān)鍵蛋白VE-cadherin在缺氧微環(huán)境下表達升高在人卵巢癌石蠟標本上初步證實具有VM的卵巢癌高表達VE-cadherin蛋白，且體外Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)在缺氧微環(huán)境下，人卵巢癌細胞上調(diào)VM形成關(guān)鍵蛋白VE-cadherin的表達。
　　結(jié)