七氟醚預(yù)處理對(duì)大鼠缺血再灌注心肌細(xì)胞自噬的影響.pdf

1、目的:通過觀察七氟醚預(yù)處理對(duì)大鼠缺血再灌注心肌細(xì)胞自噬作用的影響，探討七氟醚預(yù)處理對(duì)缺血再灌注損傷心肌早期保護(hù)作用的可能機(jī)制，為臨床應(yīng)用七氟醚提供理論參考。
　　方法:
　　1、實(shí)驗(yàn)分組與動(dòng)物模型制備
　　清潔級(jí)雄性SD大鼠45只，鼠齡8～12周，體重200～240g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為3組(n=15):假手術(shù)組（Sham組），左冠狀動(dòng)脈前降支穿線，不結(jié)扎,觀察150min;缺血再

2、灌注組(I/R組)，結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，阻斷冠脈血流缺血30min，再灌注120min制備心肌缺血再灌注模型;七氟醚預(yù)處理+缺血再灌注組（Sevo組），在缺血前30min吸入七氟醚，使呼出氣末七氟醚濃度達(dá)到2.5％，維持15min，洗脫15min后，結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，阻斷冠脈血流缺血30min，再灌注120min。
　　大鼠禁食水8h后稱重，腹腔注射3％戊巴比妥鈉(50mg/kg)麻醉，仰臥位固定，在其軀干下放置自制暖水袋，

3、軀干上方放置60w白熾燈，通過調(diào)節(jié)白熾燈到大鼠軀干的距離及更換暖水袋來維持大鼠的肛溫在37.0～37.5℃，四肢連接針形電極，通過連接監(jiān)護(hù)儀持續(xù)監(jiān)測(cè)Ⅱ?qū)?lián)心電圖。經(jīng)口氣管插管，連接嚙齒類小動(dòng)物呼吸機(jī)，行機(jī)械通氣并連接多參數(shù)麻醉氣體監(jiān)護(hù)儀檢測(cè)呼吸。于頸部正中切口剝離頸前肌肉，暴露主支氣管，用3-0絲線在主支氣管下穿線結(jié)扎氣管導(dǎo)管和主支氣管避免漏氣，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈穿刺置管檢測(cè)動(dòng)脈壓。胸前剪毛并消毒，于胸骨中線左旁開0.5cm處切開皮膚，斷

4、開3、4肋，打開心包，暴露心臟，于左心房置入套管針，輕推入左心室，測(cè)量左室發(fā)展壓。在左心耳與肺動(dòng)脈圓錐間可見與左冠狀動(dòng)脈伴行的心大靜脈，以心大靜脈為標(biāo)志在左心耳根部1～2mm處用6-0prolene帶針線穿線結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，阻斷冠脈血流30min后剪開結(jié)扎線再灌注120min，實(shí)驗(yàn)過程中間斷腹腔注射戊巴比妥鈉維持麻醉。Sham組穿線不結(jié)扎觀察150min; I/R組和Sevo組結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，阻斷冠狀動(dòng)脈血流30min后剪開

5、結(jié)扎線再灌注120min，其中Sevo組在結(jié)扎前30min進(jìn)行七氟醚預(yù)處理。缺血成功的標(biāo)志:肉眼觀察結(jié)扎部位遠(yuǎn)端心肌外膜發(fā)紺，心肌收縮運(yùn)動(dòng)減弱;MAP下降，心率由慢轉(zhuǎn)快又迅速轉(zhuǎn)慢，心電圖出現(xiàn)QRS波寬度及高度增加，ST段抬高，T波增高。再灌注成功的標(biāo)志:肉眼觀察缺血心肌顏色、左心室收縮運(yùn)動(dòng)較缺血期末好轉(zhuǎn);MAP較缺血期末升高， ST段、T波和QRS波寬及波高均顯著下降，但仍高于缺血前水平。
　　2、檢測(cè)指標(biāo)與標(biāo)本采集
　　2

6、.1血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo):監(jiān)測(cè)并記錄房室導(dǎo)管穿刺成功后穩(wěn)定10min(T0)、冠脈結(jié)扎成功即刻(T1)、缺血30min(T2)、再灌注10min(T3)、再灌注30min(T4)、再灌注1 h(T5)和再灌注2 h(T6)時(shí)的心率（HR）、平均動(dòng)脈壓(MAP)、左室收縮壓(LVSP)和左室舒張末壓(LVDEP)，計(jì)算并記錄各時(shí)間點(diǎn)的左室發(fā)展壓(LVDP=LVSP-LVDEP)。
　　2.2生化指標(biāo):再灌注120min末經(jīng)頸動(dòng)脈置管處抽取

7、動(dòng)脈血3ml，離心取其上清液，測(cè)定肌鈣蛋白Ⅰ(cTnⅠ)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)的濃度。
　　2.3梗死面積測(cè)量及心肌細(xì)胞自噬檢測(cè):取血后重新結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支，每組隨機(jī)抽取5只，Evensblue-TTC（伊文氏藍(lán)-2，3，5-三苯基氯化四氮唑）雙染色法測(cè)定心肌梗死面積。每組中隨機(jī)抽取5只，取心肌標(biāo)本用于電鏡觀察:取血后快速取下心臟在冠脈結(jié)扎線下約0.5cm處取一小塊心肌修剪成3塊1mm3心肌，置入4％戊二醛中，放入4℃冰

8、箱備用。
　　2.4 LC3-Ⅱ和Beclin-1的表達(dá)情況:每組中隨機(jī)抽取5只，取大鼠心臟左心室，置入凍存管中迅速放入液氮，采用Westeron-Blot法檢測(cè)大鼠左心室LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1三組大鼠的體重比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定結(jié)果
　　2.1平均動(dòng)脈壓與心率
　　T0-6各時(shí)間點(diǎn)各組大鼠HR比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0

9、.1）;各組大鼠T0-2時(shí)MAP比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，與Sham組比較，I/R組T3-6時(shí)MAP降低，Sevo組T5-6時(shí)MAP降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，與I/R組比較，Sevo組T3-6時(shí)MAP升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.2左室發(fā)展壓
　　三組大鼠T0-1時(shí)LVDP比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);T2-6時(shí)LVDP三組間均有差異:與Sham組比較，I/R組和Sevo

10、組T2-6時(shí)LVDP顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與I/R組比較，Sevo組T2-6時(shí)LVDP升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3、cTnⅠ和CK-MB的濃度比較
　　與Sham組比較，I/R組和Sevo組的cTnⅠ和CK-MB濃度升高(P＜0.01);與I/R組比較，Sevo組cTnⅠ和CK-MB濃度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　4、梗死面積的比較
　　Sevo組心肌梗

11、死面積為（33.5％±8.79％）較I/R組（54.2％±6.34％）顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　5、各組LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達(dá)的比較
　　與Sham組比較，I/R組與Sevo組LC3-Ⅱ和Beclin-1的表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);Sevo組與I/R組LC3-Ⅱ和Beclin-1的表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　6、心肌超微結(jié)構(gòu)變化
　　Sh

12、am組肌原纖維排列整齊，肌節(jié)清晰，線粒體結(jié)構(gòu)完整，線粒體嵴排列整齊無水腫，可見極少的自噬空泡;I/R組肌原纖維排列紊亂，出現(xiàn)斷裂及溶解現(xiàn)象，線粒體明顯腫脹，嵴中斷或消失，線粒體外膜破壞，腫脹的線粒體周圍出現(xiàn)大量的自噬空泡及不同級(jí)別的溶酶體;Sevo組心肌超微結(jié)構(gòu)損傷減輕，心肌纖維排列與I/R組比較明顯整齊，線粒體腫脹明顯減輕，自噬空泡及溶酶體的數(shù)量略有減少。
　　結(jié)論:
　　本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，七氟醚預(yù)處理早期對(duì)缺血再灌注心肌具