中華絨螯蟹Δ9和Δ6脂肪酸去飽和酶的真核表達(dá).pdf

1、脂肪酸是人類重要的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，其中的多不飽和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acids，PUFAs）是人體重要的生理活性物質(zhì)，PUFAs不僅是生物體的基本成分,同時(shí)也是生物體的生命活動(dòng)代謝產(chǎn)物,PUFAs的合成是通過(guò)一系列FAD（Fatty acid desaturase）和脂肪酸延長(zhǎng)酶的催化作用形成的。去飽和酶是PUFAs合成途徑中的關(guān)鍵酶，它控制著PUFAs的不飽和程度。Δ6脂肪酸去飽和酶（ Fatty acid

2、desaturase，Δ6-FAD）和Δ9脂肪酸去飽和酶（Fatty acid desaturase，Δ9-FAD）是PUFAs合成途徑的關(guān)鍵酶，都可將特定C-C單鍵催化成雙鍵。
　　本研究通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)得到中華絨螯蟹肝胰腺cDNA，再根據(jù)中華絨螯蟹Δ6-FAD（Δ6-FAD GenBank登錄號(hào):KP876058)和Δ9-FAD（Δ9-FAD Accession Number：JQ693685）基因的

3、cDNA序列設(shè)計(jì)引物，分別得到中華絨螯蟹Δ6-FAD和Δ9-FAD基因的開放閱讀框（ORF）。以此為材料，分別構(gòu)建釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和畢赤酵母（Pichia pastoris）表達(dá)系統(tǒng)，驗(yàn)證Δ6和Δ9-FAD的功能。并通過(guò)SDS-PAGE和Western-blotting、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC_MS）等試驗(yàn)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析驗(yàn)證。
　　釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)使用酵母INVSC1，選取表達(dá)

4、載體pYES2,分別根據(jù)Δ6和Δ9-FAD的ORF和載體pYES2的序列，設(shè)計(jì)引物,每對(duì)引物上加上6xHis標(biāo)簽，通過(guò)PCR得到含有6xHis標(biāo)簽的Δ6和Δ9-FAD目的基因序列，分別特定的快切酶，酶切目的基因和載體，再通過(guò)T4DNA連接酶連接，得到重組質(zhì)粒并送公司測(cè)序驗(yàn)證。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)細(xì)胞中，在SC-U固體培養(yǎng)上30℃基培養(yǎng)24-36h，挑取陽(yáng)性菌株，進(jìn)行酵母菌液PCR，將條帶正確的菌液送去測(cè)序驗(yàn)證，將測(cè)序正確

5、的菌株分別在16℃，25℃，30℃誘導(dǎo)表達(dá)，并在24h，48h，72h,96h取樣，樣品經(jīng)處理后用經(jīng)Westernblot分析和GC-MS檢測(cè)。
　　Δ6和Δ9-FAD基因在釀酒酵母中的表達(dá)結(jié)果顯示：分別將含有Δ6和Δ9-FAD基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化釀酒酵母后，樣品處理后經(jīng)Westernblot檢測(cè)，并沒(méi)有目的蛋白條帶；測(cè)定脂肪酸，添加外源LA和ALA的Δ6-FAD誘導(dǎo)表達(dá)組以及不添加任何外源底物的表達(dá)組沒(méi)有檢測(cè)到γ-亞麻酸（γ-Li

6、nolenic Acid，GLA）或十八碳四烯酸（C18:4）；同時(shí)，添加外源底物硬脂酸（C18:0）的Δ9-FAD誘導(dǎo)表達(dá)組以及不添加任何外源底物的表達(dá)組都沒(méi)有檢測(cè)到油酸（C18:1）。
　　畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)選取酵母GS115，選pPIC3.5K為Δ9-FAD的表達(dá)載體，選取pPICZαA為Δ6-FAD的表達(dá)載體。分別根據(jù)Δ6和Δ9-FAD的ORF和各自對(duì)應(yīng)的載體的序列，設(shè)計(jì)引物，每對(duì)引物上加上His標(biāo)簽，通過(guò)PCR得到含有Hi

7、s標(biāo)簽的Δ6和Δ9-FAD目的基因序列，分別用特定的快切酶，酶切目的基因和載體，再通過(guò)T4DNA連接酶連接，得到重組質(zhì)粒；經(jīng)Sac1線性化后，將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞中，并經(jīng)過(guò)不同濃度梯度抗性篩選，獲得高拷貝的轉(zhuǎn)化株，并挑取陽(yáng)性菌株測(cè)序驗(yàn)證，將測(cè)序正確的菌株在30℃誘導(dǎo)表達(dá)，并在48h取樣檢測(cè)。
　　Δ6和Δ9-FAD基因在畢赤酵母中的表達(dá)結(jié)果顯示：成功構(gòu)建了含有Δ6和Δ9-FAD基因的重組畢赤酵母表達(dá)菌株，在不同誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)，