線蟲ω-3脂肪酸去飽和酶基因在大腸桿菌中的表達(dá).pdf

1、多不飽和脂肪酸(PUFA)可分為ω-3和ω-6系列脂肪酸在體內(nèi)具有廣泛的生理功能和生物學(xué)效應(yīng)。人體ω-3和ω-6PUFA的比例失衡可以引起一些疾病和生理機(jī)能失調(diào)。線蟲fat-1基因表達(dá)的ω-3脂肪酸去飽和酶可以將ω-6PUFA轉(zhuǎn)化為ω-3PUFA，具有重要的醫(yī)學(xué)和營(yíng)養(yǎng)學(xué)價(jià)值。本課題擬用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建原核表達(dá)載體，使線蟲fat-1基因在大腸桿菌中表達(dá)，并對(duì)該表達(dá)產(chǎn)物的酶學(xué)活性做初步的探討，為進(jìn)一步開(kāi)展ω-3脂肪酸去飽和酶的體外酶學(xué)研究

2、奠定基礎(chǔ)。 [方法]擴(kuò)增純化含有線蟲fat-1基因的pUC18質(zhì)粒和原核表達(dá)載體pET32a(+)。采用雙酶切插入的方法，構(gòu)建fat-1基因的原核定向表達(dá)載體pET32a-fat-1，并采用酶切試驗(yàn)和DNA測(cè)序分析鑒定重組結(jié)果。用經(jīng)過(guò)鑒定的pET32a-fat-1轉(zhuǎn)化大腸桿菌DE3，采用RT-PCR方法檢測(cè)fat-1基因在大腸桿菌DE3中的轉(zhuǎn)錄活性；以ω-6PUFA為底物培養(yǎng)含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌DE3，采用IPTG誘導(dǎo)fat-

3、1基因的表達(dá)，并采用氣相色譜質(zhì)譜法分析大腸桿菌中脂肪酸的組分及其含量變化，從而分析檢測(cè)表達(dá)的ω-3脂肪酸去飽和酶活性。 [結(jié)果] (1)將擴(kuò)增菌DH5a中的重組質(zhì)粒pET32a-fat-1抽提和純化后，酶切鑒定和DNA測(cè)序的結(jié)果表明，構(gòu)建的fat-1基因原核表達(dá)載體pET32a-fat-1與理論值相符； (2)將純化的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DE3表達(dá)菌株，RT-PCR半定量分析測(cè)定結(jié)果顯示，在大腸桿菌DE3中的重組

4、質(zhì)粒pET32a-fat-1可以轉(zhuǎn)錄出fat-1的mRNA，并且轉(zhuǎn)錄活性隨IPTG誘導(dǎo)濃度的改變而改變； (3)采用氣相色譜質(zhì)譜法分析的結(jié)果顯示，以ω-6PUFA為底物培養(yǎng)含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌DE3，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，大腸桿菌中有ω-3PUFA的產(chǎn)生，并且ω-3PUFA的含量隨著IPTG誘導(dǎo)時(shí)間、培養(yǎng)溫度和底物ω-6PUFA的不同而不同。 [結(jié)論]通過(guò)雙酶切定向克隆的方法成功構(gòu)建了fat-1基因的原核定向表達(dá)載體pET