牛珀至寶微丸對內(nèi)毒素休克相關(guān)基因表達調(diào)控的影響.pdf

1、1、研究目的: 牛珀至寶微丸臨床治療感染性休克療效顯著，一氧化氮(NO)及其相關(guān)基因在內(nèi)毒素休克中對血壓調(diào)節(jié)、臟器損傷與修復(fù)起重要作用。為探討牛珀至寶微丸治療感染性休克的機理是否與一氧化氮及其相關(guān)基因相關(guān)，本研究從整體水平、細胞、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與基因調(diào)控各個層次對牛珀至寶微丸調(diào)控一氧化氮及其相關(guān)基因進行研究。 2、研究內(nèi)容、方法: 本實驗分在體實驗與離體實驗二部分。 整體實驗主要觀察牛珀至寶微丸調(diào)控NO對內(nèi)毒素

2、休克血壓、臟器損傷及修復(fù)的影響。用靜脈注射脂多糖內(nèi)毒素(LPS)1.5mg/kg、腹腔注射D-氨基半乳糖(D-GaLN)100mg/kg 造成內(nèi)毒素休克模型，用牛珀至寶微丸和一氧化氮合酶抑制劑氨基胍(AG)作干預(yù)處理，用BL-410 生理儀監(jiān)測血壓，用OlympusAU2700型全自動生化分析儀進行肝功能檢測，用HE染色觀察各臟器的病理形態(tài)，用硝酸還原酶法檢測血漿NO濃度，同位素標(biāo)記法測組織勻漿一氧化氮合酶(NOS)活性，免疫組化、We

3、sterrl blot 方法檢測誘導(dǎo)型一氧化氮合酶 (iNOS)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶 (eNOS)在各臟器組織內(nèi)的表達，用 Van Gieson 法染色檢測膠原纖維在肺組織內(nèi)的表達，免疫組化方法檢測肺組織高遷移蛋白 (HMGB<,1>)、轉(zhuǎn)化生長因子 (TGF-β<,1>)及其受體的表達，并用激光共聚焦掃描顯微鏡進一步觀察高遷移率族蛋白(HMGB<,1>)的表達。 離體實驗從細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與基因調(diào)控水平觀察牛珀至寶微丸動物血清對L

4、PS刺激RAW264.7iNOS 基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響。用硝酸還原酶法檢測測定蛋白激酶C (PKC)抑制劑對LPS誘導(dǎo)的NO生成作用，用PKC活性測定法研究LPS對PKC的激活作用；用基因重組技術(shù)構(gòu)建iNOS 熒光素酶報告基因載體；用基因轉(zhuǎn)染及報告基因檢測等方法研究牛珀至寶微丸調(diào)控LPS刺激RAW264.7細胞對iNOS啟動子活性的誘導(dǎo)作用及其與PKC的關(guān)系，以明確牛珀至寶微丸對LPS刺激RAW264.7細胞iNOS啟動子活性的誘導(dǎo)作用及

5、PKC的影響。 3、研究結(jié)果: 牛珀至寶微丸對內(nèi)毒素休克與NO影響結(jié)果顯示：LPS注射即時血壓迅速下降成穩(wěn)定的低血壓，AG 有顯著的升壓作用，用藥 30min 后血壓上升接近正常水平，至240min甚至高于原基礎(chǔ)血壓；牛珀至寶微丸血壓回升穩(wěn)定而緩慢，AG+牛珀至寶微丸有升壓作用，但并未疊加，而是使升壓作用緩和。LPS組NO 濃度持續(xù)上升，AG可明顯使NO濃度下降迅速而且穩(wěn)定，注射后 30min即回復(fù)至正常水平，240mi

6、n 后仍有繼續(xù)下降趨勢。牛珀至寶微丸組NO緩慢上升，其上升幅度高于LPS組而低于正常組。提示牛珀至寶微丸可使內(nèi)毒素休克鼠血漿NO濃度緩慢下降，抑制NO的過量生成。AG+牛珀至寶微丸的作用疊加無顯著意義。iNOS蛋白活性檢測結(jié)果顯示：LPS可致iNOS活性顯著增強，AG可抑制iNOS，牛珀至寶微丸可抑制iNOS活性，AG+牛珀至寶微丸其作用有增強趨勢。iNOS Western Blotting 結(jié)果顯示：正常組iNOS條帶缺如，LPS組i

7、NOS強陽性表達，AG組iNOS表達較弱，牛珀至寶微丸iNOS表達也較弱，但不如AG組明顯，AG+牛珀至寶微丸其作用有增強趨勢。牛珀至寶微丸對內(nèi)毒素休克各臟器損傷的形態(tài)、功能影響與iNOS關(guān)系結(jié)果顯示：AG對內(nèi)毒素性肝損傷血清ALT、AST的濃度變化無影響，牛珀至寶微丸則可以明顯改善以上肝功能指標(biāo)及肝臟病理損壞，并能減少肝細胞、枯否氏細胞、內(nèi)皮細胞的iNOS表達。內(nèi)毒素休克心臟iNOS陽性細胞分布于心臟外膜與心肌，牛珀至寶微丸能明顯降低

8、內(nèi)毒素所致iNOS表達，并能改善內(nèi)毒素休克的心臟損害。內(nèi)毒素休克腦iNOS陽性細胞分布于大腦皮質(zhì)、紋狀體、腦干、小腦等，牛珀至寶微丸能明顯降低內(nèi)毒素腦iNOS表達，并能改善內(nèi)毒素休克腦損害。內(nèi)毒素休克腎組織iNOS表達增強，牛珀至寶微丸能明顯降低內(nèi)毒素腎iNOS表達，并能改善內(nèi)毒素休克腎損害。 牛珀至寶微丸對內(nèi)毒素休克臟器損傷修復(fù)與NOS表達關(guān)系結(jié)果顯示：牛珀至寶微丸降低肺組織iNOS活性，使肺內(nèi)iNOS表達減弱、而且同時能使e

9、NOS表達增強，肺損傷減輕。對內(nèi)毒素急性肺損傷的修復(fù)表明，內(nèi)毒素肺損傷肺組織膠原纖維染色顯著增強，牛珀至寶微丸能減輕肺損傷，并能減弱肺組織膠原纖維染色。內(nèi)毒素肺損傷與修復(fù)的相關(guān)因子結(jié)果顯示：牛珀至寶微丸可增強內(nèi)毒素休克晚期關(guān)鍵核因子高遷移蛋白(HMGB<,1>)的表達，增強肺組織轉(zhuǎn)化生長因子-β<,1>及其受體表達而不產(chǎn)生纖維化。 離體實驗從細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與基因調(diào)控水平研究結(jié)果顯示：牛珀至寶微丸可負調(diào)節(jié)LPS刺激RAW264.7細

10、胞引起的PKC磷酸化激活和膜移位，并可延長PKC抑制劑H7下調(diào)NO作用時間。熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，牛珀至寶微丸可抑制LPS刺激誘導(dǎo)的iNOS啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，并可增強H7和鈣離子通道阻滯劑維拉帕米的作用。牛珀至寶微丸抑制LPS刺激RAW264.7細胞所致的NO生成增加，其機制之一是量效與時間兩方面抑制PKC激活和細胞內(nèi)鈣增加，從而影響iNOS啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。 4、研究結(jié)論: AG 過快、無限制的升壓可能對機體不

11、利。牛珀至寶微丸治療內(nèi)毒素休克與NO途徑相關(guān)，但不同于單純的一氧化氮合酶抑制劑，升壓穩(wěn)定而緩慢，可能更有利于機體恢復(fù)，這也詵明牛珀至寶微丸有平穩(wěn)的升壓作用不只是單純的NO作用途徑，而且存在某種穩(wěn)定NO濃度的機制。牛珀至寶微丸治療內(nèi)毒素休克各臟器損傷與減少iNOS表達相關(guān)，與一氧化氮合酶抑制劑不同的是能使eNOS 表達增強；對于內(nèi)毒素損傷與修復(fù)表明，牛珀至寶微丸其機理可能與增強纖維化因子TGF-β<,1>及其受體表達相關(guān)，能增強內(nèi)毒素休克