達氏鰉促性腺激素基因克隆及其表達分析.pdf

1、達氏鰉，俗稱鰉魚。物種起源于距今一億三千萬年的白堊紀，是全世界惟有黑龍江流域才有的珍貴魚類。作為白堊紀時期保存下來的古生物群之一，曾與恐龍在地球上共同生活過，其原始古樸的外形1億多年來幾乎沒有改變，具有珍貴的科研價值。達氏鰉現(xiàn)為國家二級野生保護動物，1998年聯(lián)合國華盛頓公約將其認定為瀕危物種。除此之外，達氏鰉具有很高的經濟價值，其魚卵被稱為―黑黃金‖，魚子醬是極其美味。而達氏鰉的生長尤為緩慢，性成熟周期在18年以上，因此探究達氏鰉的繁

2、育生理勢在必行。
　　促性腺激素（gonadotropin hormone,GtH）是由脊椎動物腦垂體分泌的促進性腺發(fā)育和繁殖的主要內分泌因素。主要包括促卵泡激素(follicle-stimulating hormone,FSH）、促黃體生成素（luteinizing hormon，LH）、促甲狀腺素(throtroid stimulating horme,TSH)同構成的糖蛋白激素家族。由垂體分泌的促性腺激素的生成和釋放受促黃體

3、生成素釋放激素(LH-RH)和促卵泡激素釋放激素(FSH-RH)直接調控。魚類的性成熟與促性腺激素的分泌直接相關，因此利用生物學手段，加快開展促性腺激素基因的研究至關重要。
　　本實驗對達氏鰉促性腺激素FSHβ亞基和LHβ亞基進行了基因克隆，采用的是反轉錄法（RT-PCR）和快速cDNA末端擴增法（RACE），并對其cDNA全長的序列進行了生物信息學分析，構建系統(tǒng)進化樹以及對其氨基酸進行了同源對比分析。同時，應用實時熒光定量PCR

4、技術，分別對達氏鰉促性腺激素FSHβ亞基和LHβ亞基在十種組織中的表達量進行了分析。此外，將促性腺激素的開放閱讀框導入大腸桿菌中進行了原核表達。實驗結果如下：
　?。?）設計特異性引物擴增中間片段，并用RACE方法擴增3‘端和5‘端，最后拼接cDNA全長，LHβ亞基cDNA全長596bp，F(xiàn)SH亞基cDNA全長1090bp，開放閱讀框為414bp和387bp，分別編碼了137和129個氨基酸。經過Blast比對分析，與其它鱘鰉魚類

5、相比，其氨基酸相似性均高達98％以上。對蛋白質的二級結構、三級結構、疏水性、跨膜區(qū)進行了分析，并構建了系統(tǒng)進化樹。構建了系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn)，其與中華鱘親緣關系較近，與其它硬骨魚類較遠，與哺乳動物中的人和小鼠最遠。
　?。?）對達氏鰉腦垂體、腦、肌肉、精巢、卵巢、肝、腎、腸、胃、鰓10個組織進行了熒光定量分析。結果表明，F(xiàn)SH亞基和LH亞基在大多數(shù)的組織表達量上具有一致性，腦垂體表達量最高且尤為顯著，在精巢和卵巢中有所表達，在腦中有微量

6、的表達，在其他組織中幾乎不表達。而兩個亞基的差異主要體現(xiàn)于性腺上，F(xiàn)SH亞基在精巢中表達較高，而LH亞基在卵巢中表達量較高。
　?。?）將達氏鰉促性腺激素LHβ亞基和FSHβ亞基的開放閱讀框導入Blunt-E1中，再將其質粒提取轉入BL21(DE3）里構建成原核表達載體，之后再用IPTG誘導進行蛋白表達，蛋白大小均在14kDa左右。優(yōu)化其表達條件，結果表明IPTG的濃度對蛋白表達量幾乎沒有影響，而最優(yōu)表達條件為：37℃誘導5h。再