前列腺癌與良性前列腺增生差異表達(dá)基因的克隆和初步鑒定.pdf

1、背景與目的：
　　 前列腺癌(PCa)在許多西方國(guó)家是男性最常見的惡性腫瘤之一。我國(guó)前列腺癌的發(fā)病率雖然明顯低于歐美國(guó)家,但近年來,隨著人口老齡化、生活條件及檢測(cè)手段的改善,其發(fā)病率有明顯上升的趨勢(shì)。良性前列腺增生(BPH)是老年男性最常見的前列腺良性病變。研究表明前列腺癌的發(fā)生是多因素、多基因共同作用的結(jié)果,目前對(duì)其涉及機(jī)制還知之甚少。前列腺癌和良性前列腺增生均存在上皮細(xì)胞的過度生長(zhǎng),良性前列腺增生組織基因表達(dá)的改變處于相對(duì)正

2、常的狀態(tài),前列腺癌卻因?yàn)榛蚪M的不穩(wěn)定性表現(xiàn)出異常的基因表達(dá)?；虮磉_(dá)異常是前列腺癌發(fā)生及發(fā)展的根本因?yàn)?。因?研究前列腺癌和良性前列腺增生基因表達(dá)譜的差異可以提供前列腺細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的重要生物學(xué)信息。
　　 本研究應(yīng)用熒光mRNA差異顯示技術(shù),篩選前列腺癌與良性前列腺增生的差異表達(dá)基因,并對(duì)其進(jìn)行克隆及初步鑒定,為發(fā)現(xiàn)新的可用于前列腺癌診斷和治療的分子標(biāo)記物提供科學(xué)依據(jù)。
　　 方法：
　　 一、差異表達(dá)基因的篩

3、選和克隆
　　 分別提取前列腺癌與良性前列腺增生標(biāo)本組織的總RNA,然后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,PCR擴(kuò)增后,應(yīng)用熒光mRNA差異顯示技術(shù)尋找前列腺癌與良性前列腺增生差異表達(dá)的cDNA片段,PCR再擴(kuò)增差異表達(dá)基因片段,Northern印跡雜交,排除假陽性后,經(jīng)藍(lán)白斑篩選,提取及純化質(zhì)粒后,EcoRⅠ及HindⅢ酶切鑒定。
　　 二、差異表達(dá)基因的序列測(cè)定和分析
　　 應(yīng)用末端雙脫氧法進(jìn)行DNA序列測(cè)定。在互聯(lián)網(wǎng)上經(jīng)B

4、LAST軟件進(jìn)行檢索,將測(cè)序結(jié)果與國(guó)際基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性分析。
　　 結(jié)果：
　　 通過熒光MRNA差異顯示技術(shù),發(fā)現(xiàn)87條差異表達(dá)的cDNA條帶,切膠分離其中的20條,經(jīng)過PCR再擴(kuò)增和克隆、測(cè)序后共得14個(gè)差異基因片段序列,在前列腺癌組織中高表達(dá)的7個(gè)cDNA片段中:1個(gè)有明顯的同源序列,功能已知；4個(gè)雖然已經(jīng)有同源基因序列,但功能未知；2個(gè)未找到高度同源序列。在前列腺癌組織中低表達(dá)的7個(gè)cDNA片段中:3個(gè)有

5、明顯的同源序列,功能已知；1個(gè)雖然已經(jīng)有同源基因序列,但功能未知；2個(gè)未找到高度同源序列；1個(gè)無任何同源信息。
　　 結(jié)論：
　　 一、前列腺癌組織基因表達(dá)與良性前列腺增生組織相比存在較大的差異,熒光mRNA差異顯示技術(shù)能有效的篩選出前列腺癌與良性前列腺增生的差異表達(dá)基因。
　　 二、所篩選出的差異表達(dá)基因片段,通過克隆、測(cè)序后,進(jìn)行同源性分析,確定其身份,對(duì)進(jìn)一步了解這些基因的功能及其在前列腺癌中的作用有重要臨