未成熟卵體外培養(yǎng)成熟機(jī)制的探討.pdf

1、本文研究目的： 1．研究探討未刺激周期未成熟卵體外成熟/體外受精-胚胎移植技術(shù)(IVM/IVF-ET)在治療多囊卵巢綜合征不孕治療中的應(yīng)用，并探討影響IVM治療成功率的因素。 2．本課題通過(guò)研究體外成熟培養(yǎng)后卵子發(fā)育潛能與卵丘顆粒細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系，旨在能夠預(yù)測(cè)卵母細(xì)胞體外發(fā)育潛能，并指導(dǎo)臨床選擇優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行移植，提高移植成功率。 3．探討體外培養(yǎng)中人卵母細(xì)胞形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)與人卵母細(xì)胞體外發(fā)育潛能的關(guān)系及超微結(jié)構(gòu)的變

2、化規(guī)律。 研究材料與方法： 1．選取有胰島素抵抗(IR)的PCOS患者48例，進(jìn)行IVM/IVF-ET治療，其中隨機(jī)選取24例在IVM治療前服二甲雙胍進(jìn)行預(yù)治療3個(gè)月，另24例直接進(jìn)行IVMIVF-ET治療，共92個(gè)周期，作為治療組。同時(shí)期接受ICSI-ET的非PCOS患者共73例98個(gè)周期作為對(duì)照組。所有患者均測(cè)定基礎(chǔ)性激素水平，OGTT及5次INS水平，ELISA法測(cè)定血清卵泡液中IGF-1、IGFBP-1以及瘦素水

3、平。統(tǒng)計(jì)獲卵數(shù)、成熟卵數(shù)、受精卵數(shù)、卵裂數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、移植周期數(shù)，并對(duì)各組臨床資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 2．標(biāo)本來(lái)源于2006年1月～4月就診于沈陽(yáng)204醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心的多囊卵巢綜合征患者，采用B超引導(dǎo)下經(jīng)陰道穿刺取卵，獲得的未成熟卵子經(jīng)體外培養(yǎng)32小時(shí)后對(duì)卵行胞漿內(nèi)單精子顯微注射(intracytoplasmic sperm injectionICSI)，在顯微注射受精前對(duì)卵進(jìn)行消化脫去顆粒細(xì)胞，將這些顆粒細(xì)胞分別收集起來(lái)，用

4、TUNEL方法進(jìn)行染色，用光鏡進(jìn)行觀察，記數(shù)每一標(biāo)本的顆粒細(xì)胞的凋亡率，并與卵子的成熟情況和卵子質(zhì)量評(píng)分及發(fā)育成的胚胎評(píng)分做比較。 3．運(yùn)用光鏡觀察體外培養(yǎng)前生發(fā)泡期(GV期)、培養(yǎng)后生發(fā)泡破裂但仍處于MⅠ期的未成熟卵母細(xì)胞和達(dá)到MⅡ期的成熟卵母細(xì)胞的形態(tài)，并將卵母細(xì)胞分為優(yōu)質(zhì)與非優(yōu)質(zhì)，同時(shí)觀察顆粒細(xì)胞發(fā)育情況，并與卵母細(xì)胞體外發(fā)育潛能進(jìn)行比較；用透射電鏡觀察卵母細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，總結(jié)其變化規(guī)律。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1．

5、IVM/IVF-ET組與常規(guī)ICSI組相比成熟卵率(71.0％；86.9％)、受精卵率(66.1％；80.2％)、卵裂率(52.2％；74.4％)、優(yōu)質(zhì)胚胎率(24.4％；54.2％)、臨床妊娠率(25.0％；34.7％)均顯著下降(P<0.05)。各影響因素中，只有瘦素水平對(duì)IVM成功率有影響(P<0.05)，瘦素低預(yù)測(cè)IVM妊娠率高；進(jìn)行二甲雙胍預(yù)治療可以提高IVM的妊娠率(P<0.05)，對(duì)于取卵數(shù)、成熟率、受精率和卵裂率沒(méi)有影響

6、(P>0.05)。 2．本研究共對(duì)206個(gè)卵母細(xì)胞的顆粒細(xì)胞進(jìn)行了凋亡率的觀察。在對(duì)卵母細(xì)胞進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)前，根據(jù)其形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行評(píng)分，分別記數(shù)不同評(píng)分卵子的顆粒細(xì)胞的凋亡率，發(fā)現(xiàn)隨著卵子評(píng)分的降低，顆粒細(xì)胞凋亡率逐漸升高。其中，0’卵母細(xì)胞的顆粒細(xì)胞的平均凋亡率與評(píng)分為3’和4’的卵母細(xì)胞的顆粒細(xì)胞的平均凋亡率相比顯著增高(P<0.01)。經(jīng)體外成熟培養(yǎng)后，隨著卵子成熟程度的降低，凋亡率升高，褪變死亡的卵子凋亡率最高。退變死

7、亡的卵母細(xì)胞的顆粒細(xì)胞的平均凋亡率顯著高于獲得成熟的MⅡ期卵母細(xì)胞(P<0.01)；對(duì)116個(gè)經(jīng)體外成熟培養(yǎng)后達(dá)到MⅡ期的卵進(jìn)行胞漿內(nèi)單精子顯微注射和胚胎培養(yǎng)，對(duì)胚胎進(jìn)行評(píng)分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)能受精并且受精后能夠形成胚胎的卵的顆粒細(xì)胞平均凋亡率明顯低于不能受精或受精后不分裂的卵的顆粒細(xì)胞平均凋亡率，這說(shuō)明隨著卵子發(fā)育潛能的降低，顆粒細(xì)胞凋亡率逐漸升高。 3．優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞與非優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞比較，受精率和優(yōu)質(zhì)胚胎率均明顯增高(P<0.05)；

8、顆粒細(xì)胞(GC)層數(shù)代表顆粒細(xì)胞的發(fā)育情況，GC≥6的卵母細(xì)胞卵裂率和優(yōu)質(zhì)胚眙率高于GC層數(shù)少者，與GC<3的卵母細(xì)胞相比差異有顯著性(P<0.05)。超微結(jié)構(gòu)觀察中發(fā)現(xiàn)：GV期卵母細(xì)胞微絨毛短小稀少；核偏一側(cè)，核仁致密化。培養(yǎng)后卵母細(xì)胞微絨毛粗大增多；細(xì)胞器豐富，高爾基體周圍有許多分泌小泡；線粒體和脂滴伴行：卵丘細(xì)胞的胞質(zhì)突起與卵母細(xì)胞的微絨毛間形成縫隙連接，卵丘細(xì)胞之間形成較多橋粒。成熟的卵母細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體減少，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

9、發(fā)達(dá)，線粒體幼稚化，脂滴融合，皮質(zhì)顆粒沿質(zhì)膜下呈線行排列，細(xì)胞連接減少，第一極體含多種細(xì)胞器。非優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞線粒體大量存在膜和嵴模糊、膨大的現(xiàn)象，有的極體碎裂，透明帶形態(tài)不正常，其周圍卵丘細(xì)胞的凋亡率較高。 研究結(jié)論： 1．未刺激周期IVM/IVF-ET技術(shù)對(duì)于PCOS患者具有一定的治療效果，可以應(yīng)用于臨床PCOS患者的不孕治療，是臨床有效治療PCOS的新途徑。各影響因素中，低瘦素水平是預(yù)測(cè)高IVM成功率的指標(biāo)，對(duì)于有I

10、R的PCOS患者進(jìn)行二甲雙胍預(yù)治療有助于提高IVM成功率。 2．卵子發(fā)育潛能與顆粒細(xì)胞凋亡之間具有密切的關(guān)系，可以通過(guò)測(cè)定顆粒細(xì)胞凋亡率來(lái)初步預(yù)測(cè)卵子的發(fā)育潛能。并且卵子能否經(jīng)體外培養(yǎng)達(dá)到成熟，以及能否獲得優(yōu)質(zhì)的胚胎與卵子周圍顆粒細(xì)胞的功能狀態(tài)有一定關(guān)系。 3．通過(guò)光學(xué)顯微鏡評(píng)價(jià)卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞形態(tài)，并與其發(fā)育潛能進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，卵母細(xì)胞形態(tài)規(guī)則、胞質(zhì)均勻，有光澤，有一定的卵周間隙，顆粒細(xì)胞層數(shù)≥3層是具有較好的發(fā)育潛能