高壓氧對大鼠移植腎組織自噬影響的初步研究.pdf

1、目的:通過建立同系大鼠腎移植缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,IRI)模型,觀察自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule associated protein1 light chain3,LC3)和白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)在移植腎組織和血中的表達(dá)變化,并采用高壓氧(hyperbaric oxygenation,HBO)治療對腎IRI進(jìn)行干預(yù),以進(jìn)一步探索

2、腎IRI的發(fā)生機制及HBO治療對缺血再灌注腎組織自噬及炎癥反應(yīng)的影響,試圖為臨床腎IRI的防治提供新的理論依據(jù)和防治策略。
　　方法:選用 SPF級雄性 SD大鼠,隨機分為假手術(shù)組、腎移植組以及腎移植+HBO治療組(HBO治療組),每組又分為1 h、3 h和5 h組。腎移植組單純行腎移植手術(shù), HBO治療組將腎移植后的大鼠分別于再灌注后0h、2h和4h置于動物實驗氧艙內(nèi)行HBO治療1h,假手術(shù)組僅切除右腎,不做腎移植手術(shù)。腎移植組

3、和HBO治療組均于腎移植后1h、3h和5h時處死大鼠,留取移植腎組織和血標(biāo)本,假手術(shù)組也于術(shù)后相應(yīng)時點處死大鼠并留取左腎組織和血標(biāo)本。采用HE染色觀察腎組織的病理改變,采用免疫組織化學(xué)法、激光共聚焦掃描熒光顯微鏡(laser scanning confocal fluorescence microscope,LCFM)以及實時熒光定量PCR(real time-PCR)檢測LC3蛋白和mRNA的表達(dá),采用生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(

4、enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測血中IL-6的含量,采用全自動生化分析儀檢測血清肌酐(serum creatinine, SCr)。
　　結(jié)果:
　　1.腎組織病理變化:假手術(shù)組腎組織結(jié)構(gòu)正常。腎移植組可見腎小球體積增大,伴中性粒細(xì)胞浸潤,腎小管管腔擴(kuò)張,可見蛋白管型和紅細(xì)胞管型,小管上皮細(xì)胞明顯腫脹,呈顆粒樣變性。HBO治療組仍見腎小球體積增大,但僅伴極少量中性粒細(xì)胞浸

5、潤,腎小管上皮細(xì)胞腫脹和腎小管擴(kuò)張減輕,蛋白管型和紅細(xì)胞管型有所減少。
　　2.腎功能改變:在1h、3h和5h各時間點,與假手術(shù)組比較,腎移植組和HBO治療組SCr值均顯著增高(P<0.05);與腎移植組比較,HBO治療組在1h、3h時無明顯差異(P>0.05),在5h時SCr值則明顯降低(P<0.05)。在同一組內(nèi),假手術(shù)組在1h、3h、5h組SCr值無明顯差異(P>0.05),腎移植組在1h、3h、5h組,SCr值隨時間延長,

6、逐步顯著增高(P<0.05)。HBO治療組3h和5h組與1h組比較,SCr值顯著增高(P<0.05),3h組和5h組之間SCr值則無明顯差異(P>0.05)。
　　3.血中炎癥因子IL-6含量的變化:在1h、3h和5h各時間點,與假手術(shù)組比較,腎移植組IL-6水平顯著增高(P<0.05),HBO治療組在1h時IL-6水平增高不明顯(P>0.05),而在3h、5h時IL-6水平則顯著增高(P<0.05);HBO治療組與腎移植組比較,

7、在1h時IL-6水平明顯降低(P<0.05),而在3h、5h時兩者無顯著差異(P>0.05)。在同一組內(nèi),假手術(shù)組和HBO治療組在3h和5h組IL-6水平均明顯高于1h組(P<0.05),隨時間延長,IL-6水平呈遞增趨勢,而腎移植組在1h、3h、5h組,IL-6水平無明顯差異(P>0.05)。根據(jù)血中IL-6和SCr結(jié)果行相關(guān)分析,發(fā)現(xiàn)IL-6和SCr呈顯著正相關(guān)(r=0.607,P<0.05)。
　　4.腎組織自噬(LC3)的

8、表達(dá)變化
　　(1)免疫組織化學(xué)法檢測LC3表達(dá):結(jié)果顯示,LC3蛋白主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞,少量表達(dá)于腎小球。對各組LC3表達(dá)進(jìn)行相對定量分析(平均光密度,MOD)發(fā)現(xiàn),與腎移植組比較,HBO治療組LC3表達(dá)水平在1h和3h時無顯著差異,而在5h時則明顯增高(P<0.05);與假手術(shù)組比較,腎移植組LC3表達(dá)水平在各時間點均輕度增高,但無顯著差異(P>0.05)。
　　(2)激光共聚焦掃描熒光顯微鏡檢測LC3表達(dá):發(fā)現(xiàn)綠

9、色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)-LC3光點主要分布于腎小管上皮細(xì)胞。
　　(3)腎組織LC3 mRNA的表達(dá)變化:在1h、3h和5h各時間點,與假手術(shù)組比較,腎移植組LC3 mRNA的表達(dá)水平無明顯差異(P>0.05),HBO治療組在1h時LC3 mRNA表達(dá)水平無明顯差異(P>0.05),而在3h、5h時LC3 mRNA的表達(dá)水平則顯著增高(P<0.05);與腎移植比較,HBO治療組在1

10、h、3h時LC3 mRNA的表達(dá)水平無明顯差異(P>0.05),在5h時LC3 mRNA的表達(dá)水平則顯著增高(P<0.05)。在同一組內(nèi),假手術(shù)組和腎移植組在1h、3h、5h組LC3 mRNA的表達(dá)水平無明顯差異(P>0.05),HBO治療組在1h、3h、5h組,LC3 mRNA的表達(dá)水平隨時間延長逐步顯著增高(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.腎移植后明顯的炎癥反應(yīng)是缺血再灌注后腎功能損害加重的機制之一;
　　2

11、.正常腎組織存在基礎(chǔ)水平的自噬,腎缺血再灌注損傷后腎組織自噬仍保持在基礎(chǔ)水平,提示缺血再灌注損傷對自噬可能具有抑制作用;
　　3.腎缺血再灌注后,高壓氧在早期可以明顯減輕組織炎癥反應(yīng);高壓氧治療明顯上調(diào)腎組織自噬,腎功能得到保護(hù),這可能是高壓氧減輕早期腎缺血再灌注損傷的又一重要分子機制;
　　4.高壓氧治療在腎缺血再灌注損傷早期過程中的不同時間段通過不同的干預(yù)機制發(fā)揮腎保護(hù)作用,因此高壓氧早期干預(yù)對腎缺血再灌注損傷的防治尤為