水稻硝態(tài)氮跨膜運輸?shù)纳砼c分子機理.pdf

1、許多的研究結(jié)果表明水稻具有一定的泌氧能力，水稻根際中存在著一定的硝態(tài)氮，并且水稻硝態(tài)氮營養(yǎng)非常重要。但是，水稻為什么會存在對硝態(tài)氮營養(yǎng)的基因型差異，水稻如何吸收和再利用硝態(tài)氮的機理還不是很清楚。本博士論文采用水培條件分別研究了水稻細(xì)胞硝酸鹽活度；硝態(tài)氮對不同水稻品種生長和氮代謝的影響；不同水稻品種吸收硝態(tài)氮生理與分子生理學(xué)差異；水稻硝酸鹽高親和運輸系統(tǒng)基因的結(jié)構(gòu)與功能；硝態(tài)氮的再利用以及外界硝態(tài)氮對細(xì)胞硝酸鹽調(diào)節(jié)作用。試圖通過以上的內(nèi)容

2、揭示水稻跨膜運輸硝態(tài)氮的生理與分子機理。 本論文首先介紹了選擇性微電極實時測定水稻根系和葉片活體細(xì)胞膜電位與硝酸鹽活度的方法原理及注意事項。雙阻離子選擇性微電極測定是一種利用化學(xué)選擇，將化學(xué)信號轉(zhuǎn)換成電信號來專一測定某一離子的方法。測定溶液中的硝態(tài)氮利用與感應(yīng)膜上的硝酸根離子置換反應(yīng)來引起感應(yīng)膜上的電荷變化，通過Nernst方程就可以利用電荷的變化量得到離子活度。一般微電極與溶液中硝酸鹽的濃度呈對數(shù)曲線的關(guān)系，斜率為48～58m

3、V，具有硝酸鹽濃度有較低的檢出限(0.0001M左右)，因此該方法是一種選擇性高、靈敏、經(jīng)濟的測定植物活體細(xì)胞中離子活度的方法。水稻生長至3到4葉期時，根系和葉片硝酸鹽的活度范圍測定結(jié)果表明，細(xì)胞質(zhì)硝酸鹽活度為2到5mM，低氮時液泡硝酸鹽為15到20mM，高氮時為35到65mM。植物所吸收的硝態(tài)氮都集中在液泡中，所以提高植物液泡硝態(tài)氮的再利用效率對于提高氮素利用率非常重要。 水稻對硝態(tài)氮的利用主要取決于硝態(tài)氮的吸收效率和利用效率

4、。本論文通過比較4個品種(秈優(yōu)63，揚稻6號，農(nóng)墾57和泗優(yōu)917)研究不同水稻品種對硝態(tài)氮的利用差異。1mM硝態(tài)氮氮素營養(yǎng)條件下，揚稻的生物量最大，農(nóng)墾的最小。揚稻總氮含量遠(yuǎn)高于農(nóng)墾，說明揚稻對硝態(tài)氮的吸收效率高于農(nóng)墾。揚稻與農(nóng)墾硝酸還原酶酶活存在顯著差異，但是谷氨酰胺合成酶活差異不大，說明導(dǎo)致?lián)P稻與農(nóng)墾硝態(tài)氮營養(yǎng)的差異主要來自硝態(tài)氮的吸收效率，而利用效率的差異主要是發(fā)生在同化的前期。所以主要研究了水稻對硝態(tài)氮的吸收過程。 利

5、用單電極測定了根系表皮細(xì)胞受硝態(tài)氮刺激而發(fā)生的膜電位的變化量(△Em)，即硝態(tài)氮跨膜內(nèi)向運輸。發(fā)現(xiàn)四個品種在低濃度(＜1mM)硝態(tài)氮處理條件下存在顯著差異。但是在高濃度(10mM)硝態(tài)氮處理條件下幾乎沒有差異。揚稻6號和秈優(yōu)63比農(nóng)墾57和泗優(yōu)917對硝態(tài)氮的反應(yīng)更加敏感。1mM和10mM硝態(tài)氮處理下?lián)P稻6號和秈優(yōu)63的△Em非常相近，但是農(nóng)墾57和泗優(yōu)917的△Em是隨著硝態(tài)氮濃度的增加而增加的。利用揚稻6號根系細(xì)胞作了系列硝態(tài)氮濃度

6、的處理，通過Michaelis-Menten擬和方程得到influx的Km為0.17mM，即細(xì)胞膜上的硝態(tài)氮運輸?shù)鞍椎腒m總體表現(xiàn)為低親和吸收系統(tǒng)。這與揚稻6號通過改進(jìn)的硝態(tài)氮耗竭法得到凈吸收動力學(xué)參數(shù)Km很相近，這說明改進(jìn)的硝態(tài)氮耗竭法也可以基本上反映硝態(tài)氮運輸?shù)鞍椎腒m。同時本論文也對其它三個水稻品種進(jìn)行了凈吸收動力學(xué)參數(shù)的測定，發(fā)現(xiàn)揚稻6號和秈優(yōu)63的凈吸收動力學(xué)為單相曲線而農(nóng)墾57和泗優(yōu)917表現(xiàn)為雙相系統(tǒng)，其中一相的Km為0.

7、2mM即低親和系統(tǒng)，另一相的Km為0.03mM。揚稻根系吸收硝態(tài)氮Vmax顯著高于農(nóng)墾的Vmax。所有電生理和凈吸收實驗結(jié)果都說明，揚稻和農(nóng)墾的硝酸鹽跨膜運輸存在顯著差異。本論文通過下面的硝酸鹽運輸?shù)鞍谆虻谋磉_(dá)實驗，進(jìn)一步驗證了生理上的吸收差異也發(fā)生在分子水平的基因表達(dá)水平上。 對OsNRT1.1OsNRT2s和OsNAR2s基因進(jìn)行了在不同品種和組織中的表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)在這4個品種主要表達(dá)的基因為OsNRT1.1和OsNRT2

8、.1。在根系硝酸鹽運輸?shù)鞍谆虻谋磉_(dá)模式與吸收動力學(xué)的表現(xiàn)基本符合，除了泗優(yōu)917。其中揚稻6號，秈優(yōu)63都是以O(shè)sNRT1.1為主，OsNRT2s表達(dá)比OsNRT1.1要低；而農(nóng)墾57以表達(dá)OsNRT2s比OsNRT1.1表達(dá)量高。在葉片低濃度硝態(tài)氮條件下主要表達(dá)OsNRT2s而高濃度硝態(tài)氮條件下主要表達(dá)OsNRT1.1。但是農(nóng)墾57葉片硝酸鹽運輸?shù)鞍妆磉_(dá)量相對來說一直比較低。同時還發(fā)現(xiàn)OsNRT2.1和OsNAR2.1只有在硝態(tài)氮存

9、在的條件下存在著同步表達(dá)的關(guān)系，當(dāng)在銨鹽培養(yǎng)的條件下，OsNRT2.1和OsNAR2.1間不存在同步表達(dá)，這暗示著水稻中OsNRT2.1和OsNAR2.1間的互作是受氮素形態(tài)調(diào)控的。OsNRT2.1與OsNRT2.3表達(dá)模式是受外界pH影響的，在低pH和高pH條件下OsNRT2.2/OsNRT2.3在總的高親和系統(tǒng)的表達(dá)將顯著增加。本實驗結(jié)果表明，當(dāng)外界硝態(tài)氮在1mM的條件下，揚稻主要以高Vmax的低親和運輸系統(tǒng)來吸收硝態(tài)氮，農(nóng)墾主要以

10、低Vmax的高親和運輸系統(tǒng)吸收硝態(tài)氮。 由于水稻在水田可利用的硝態(tài)氮的量很低，本文主要對水稻硝酸鹽高親和運輸?shù)鞍自诮Y(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了分析。結(jié)果表明OsNRT2s可以分成兩類，1)OsNRT2.1(氨基酸序列分析與HvNRT2.1非常相近)對硝酸鹽吸收需要OsNAR2.1；2)OsNRT2.2，OsNRT2.3自己具有硝酸鹽的吸收功能。通過對基因結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，OsNRT2.2與OsNRT2.3在染色體1的同一位點中，OsNRT2.2的O

11、RF在OsNRT2.3的ORF中。另外，Genbank中對OsNRT2.4的分析結(jié)果表明該基因的基因組DNA序列的3’序列缺失(即該基因的mRNA5’段缺失)，所以認(rèn)為該基因可能沒有活性。同時也對4個基因的啟動子、內(nèi)含子以及蛋白質(zhì)序列結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。OsNRT2.3和OsNRT2.2在蛙卵中表達(dá)的結(jié)果表明，這兩個基因為硝酸鹽運輸?shù)鞍谆?，可以運輸硝酸鹽和亞硝酸鹽。其中OsNRT2.3的Km=0.45mM且不隨膜電位改變而改變；該基因在蛙

12、卵中的表達(dá)時表現(xiàn)出對細(xì)胞質(zhì)pH敏感特征，即在發(fā)生硝酸鹽吸收后需要一定用高pH溶液來恢復(fù)其工作的活力。通過測定蛀卵細(xì)胞質(zhì)pH的變化，發(fā)現(xiàn)0.2個單位的細(xì)胞質(zhì)pH的上升就使得OsNRT2.3再次工作了。15N-NO3-吸收結(jié)果表明，注射了OsNRT2.3和OsNRT2.2蛙卵對可以吸收大量的硝酸鹽當(dāng)外界硝酸鹽濃度為0.5mM時，但不是每個注射基因的蛙卵都能表現(xiàn)出吸收的活性。另外單注射OsNRT2.1的蛙卵沒有表現(xiàn)出硝酸鹽吸收的活性，而同時注

13、射OsNRT2.1和OsNAR2.2的蛙卵也沒有表現(xiàn)出吸收的活性，說明OsNAR2.2不能與OsNRT2.1互作使OsNRT2.1行使運輸硝酸鹽的功能。而OsNAR2.2也沒有參與OsNRT2.2，OsNRT2.3的功能表達(dá)過程。 本論文最后研究了不同水稻品種對硝態(tài)氮的再利用效率的差異。揚稻6號(YD)農(nóng)墾57(NK)在10mM硝態(tài)氮培養(yǎng)條件下根系細(xì)胞質(zhì)與液泡硝態(tài)氮活度沒有顯著的差異，葉片中液泡硝態(tài)氮活度也沒有顯著的差異，但是葉

14、片細(xì)胞質(zhì)中硝態(tài)氮的活度，揚稻6號(YD)要高于農(nóng)墾57(NK)。當(dāng)發(fā)生氮素饑餓時不論根系還是葉片，揚稻6號(YD)液泡硝態(tài)氮再遷移到細(xì)胞質(zhì)中的速率比農(nóng)墾57(NK)快。另外，木質(zhì)部傷流液的結(jié)果表明，在10mM硝態(tài)氮供給條件下，揚稻6號(YD)在木質(zhì)部的硝態(tài)氮的量要低于農(nóng)墾57(NK)，在饑餓條件下兩個品種木質(zhì)部中硝態(tài)氮同時快速下降，但是揚稻6號(YD)木質(zhì)部硝態(tài)氮下降的幅度比農(nóng)墾57(NK)大。在10mM硝態(tài)氮供給條件下，揚稻6號(YD

15、)和農(nóng)墾57(NK)葉片中硝酸還原酶活性的最大值(NRAmax)沒有差異，但是處于活性狀態(tài)的硝態(tài)氮還原酶的活性(NRAact)揚稻6號(YD)要比農(nóng)墾57(NK)高3倍左右。在缺氮24小時后，揚稻6號(YD)硝酸還原酶活性最大值沒有減少，而農(nóng)墾57(NK)硝酸還原酶活性最大值減少了79.7％。揚稻6號(YD)和農(nóng)墾57(NK)的NRAact都比饑餓前顯著降低了。OsNia1和OsNia2表達(dá)結(jié)果表明OsNia1對缺氮反應(yīng)比OsNia2快