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文檔簡介
1、人涎腺粘液表皮樣癌(MucoepidermoidCaecinoma,MEC)來源于涎腺導(dǎo)管上皮,是口腔頜面部較為常見的惡性腫瘤,低分化的涎腺粘液表皮樣癌侵襲和轉(zhuǎn)移能力強,而腫瘤轉(zhuǎn)移往往是腫瘤患者死亡的主要原因。涎腺粘液表皮樣癌的治療目前仍主要以傳統(tǒng)的手術(shù)、放療和化療為主,但療效欠佳,尤其是低分化型粘液表皮樣癌患者,5年生存率低。因此探索新的療法,尤其是如何抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移尤為重要,以期提高對涎腺粘液表皮樣癌的療效。 RNA干擾(R
2、NAinterference,RNAi)是特異基因表達(dá)沉默的強有力手段之一,廣泛存在于從真菌到植物,從無脊椎動物到哺乳動物的多種生物體中。自1998年Fire命名RNA干擾以來,RNAi研究進(jìn)展很快,成為分子生物學(xué)領(lǐng)域最熱門的研究課題之一。近年來研究表明,RNAi技術(shù)在腫瘤、病毒感染性疾病和某些功能獲得性遺傳疾病的治療中具有巨大的應(yīng)用潛力;RNAi用于腫瘤治療較之先前的腫瘤基因治療方法具有高度的特異性,高效率,存在放大效應(yīng),作用廣泛并可
3、遺傳的特點。因此針對癌基因在腫瘤細(xì)胞中引發(fā)RNAi效應(yīng),將有可能開辟腫瘤基因治療的新途徑。 本研究以人涎腺粘液表皮樣癌高轉(zhuǎn)移Ms細(xì)胞為研究對象,首次探討利用RNAi技術(shù)沉默轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforminggrowthfactorbeta,TGF-β1)基因后對Ms細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。首先采用基因芯片技術(shù)篩選涎腺粘液表皮樣癌高低轉(zhuǎn)移細(xì)胞的差異表達(dá)基因,發(fā)現(xiàn)TGF-β1在Ms細(xì)胞中高表達(dá)。TGF-β1是TGF-β家族最
4、重要的成員之一,可刺激腫瘤組-3-織內(nèi)新生血管形成,促進(jìn)ECM的合成,有利于腫瘤細(xì)胞的生長;還可刺激瘤細(xì)胞分泌蛋白酶,增強癌細(xì)胞的浸潤能力;增加粘附蛋白、糖蛋白等細(xì)胞外間質(zhì)成分聚集,有助于癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。在包括乳腺癌、胃癌、前列腺癌、膀胱癌、肺癌、肝癌等多數(shù)腫瘤中均可觀察到TGF-β1的高表達(dá),且與侵襲轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后相關(guān),但與人涎腺粘液表皮樣癌的相關(guān)性研究尚未見報道。本研究以TGF-β1為靶基因,主要研究方法和結(jié)果包括以下幾個方面:1.T
5、GF-β1在人涎腺粘液表皮樣癌高低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系中的表達(dá)人類基因組分類芯片(BioStarH-I)篩選MEC-1細(xì)胞及Ms細(xì)胞差異表達(dá)基因,選定靶基因TGF-β1,用RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)和Westernblot進(jìn)一步檢測TGF-β1在MEC-1細(xì)胞和Ms細(xì)胞中的差異表達(dá)。結(jié)果顯示TGF-β1在Ms細(xì)胞中高表達(dá)。 2.TGF-β1shRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定按照siRNA設(shè)計原則,設(shè)計針對TGF-β1基因的shRNA,構(gòu)建
6、pWH1-TGF-β1真核表達(dá)載體,應(yīng)用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染Ms細(xì)胞,600μg/mlG418篩選21d。用RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)和Westernblot證實穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TGF-β1shRNA后TGF-β1mRNA和蛋白的表達(dá)水平被顯著抑制。 3.TGF-β1shRNA對Ms細(xì)胞形態(tài)和增殖的影響應(yīng)用光鏡和電鏡觀察發(fā)現(xiàn),TGF-β1shRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞體積較大,多核巨核細(xì)胞少見,表面微絨毛較少,胞質(zhì)出現(xiàn)空泡變性,
7、線粒體腫脹,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張,核漿比例變小,核仁減小,數(shù)目減少,核分裂像減少。細(xì)胞生長曲線測定、克隆形成試驗、裸鼠頜下腺原位移植瘤等方法,發(fā)現(xiàn)用TGF-β1shRNA轉(zhuǎn)染Ms細(xì)胞使細(xì)胞體外和裸鼠體內(nèi)生長受到抑制。細(xì)胞計數(shù)法計算實驗組、空載體組、對照組細(xì)胞群體倍增時間分別為29.0h,28.8h,27.1h。TGF-β1shRNA轉(zhuǎn)染對Ms細(xì)胞軟瓊脂克隆形成抑制率為54.5%;平板克隆形成抑制率為43.4%;流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示S期和G2期細(xì)胞比
8、例下降,PI值下降了17.4%;裸鼠頜下腺原位移植瘤抑制率為59.0%。 4.TGF-β1shRNA對Ms細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移特性的影響同質(zhì)粘附試驗顯示隨著振蕩時間的延長,粘附細(xì)胞逐漸增多。Ms細(xì)胞轉(zhuǎn)染了TGF-β1shRNA后,30min同質(zhì)粘附率升高了18.6%;細(xì)胞在-4-Matrigel和FN基質(zhì)表面上1h的粘附率為39.5%和35.3%;體外遷移試驗顯示細(xì)胞在Matrigel基質(zhì)上的移動抑制率為37.7%;體外侵襲試驗顯示侵
9、襲抑制率為37.3%;明膠電泳法檢測結(jié)果表明基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2活性降低,MMP-9活性無明顯變化;裸鼠肺結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移抑制率為47.6%。 5.TGF-β1shRNA對Ms細(xì)胞Ki-67、VEGF和uPA蛋白表達(dá)的影響應(yīng)用免疫熒光和免疫組化法檢測Ki-67、VEGF和uPA蛋白表達(dá)的變化發(fā)現(xiàn),Ms細(xì)胞轉(zhuǎn)染了TGF-β1shRNA后,Ki-67、VEGF和uPA蛋白的表達(dá)顯著降低。 結(jié)論:1.TGF-β1基因沉默可導(dǎo)致Ms
10、細(xì)胞增殖能力、體外遷移和侵襲能力降低,并能有效抑制Ms細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移,提示TGF-β1與Ms細(xì)胞的增殖及高轉(zhuǎn)移性有關(guān); 2.TGF-β1基因沉默后Ms細(xì)胞增殖能力,轉(zhuǎn)移力下降,但不能完全遏制,提示腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多基因多因素調(diào)控的過程; 3.轉(zhuǎn)染TGF-β1shRNA的Ms細(xì)胞Ki-67、VEGF和uPA的蛋白表達(dá)均下降,提示TGF-β1和Ki-67、VEGF及uPA在Ms細(xì)胞中的表達(dá)存在內(nèi)在關(guān)聯(lián)。 4.TGF-β
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