siRNA介導的Bmi-1基因沉默對Hela細胞生物學行為的影響.pdf

1、目的：原癌基因Bmi-1屬于PcG家族一員，決定著正常干細胞及腫瘤干細胞的自我更新能力。近年來發(fā)現(xiàn)Bmi-1基因在多種腫瘤細胞及惡性腫瘤中表達上調(diào)，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展預后密切相關，因而有望成為腫瘤治療中新的基因靶點和輔助診斷的指標。本研究根據(jù)Bmi-1基因設計四條siRNA，把它克隆到真核表達質(zhì)粒pGensil-2上；選擇人宮頸癌細胞系Hela細胞作為研究對象，通過轉(zhuǎn)染Bmi-1 siRNA表達載體進入Hela細胞來沉默Bmi-1基因的

2、表達，以觀察其對Hela細胞生物學行為的影響并探討其機制。 方法：1、根據(jù)GENEBANK中的．Bmi-1 mRNA Sequence NM_005180，設計四條Bmi-1 siRNA序列和一條隨機序列的陰性對照，應用NCBI的網(wǎng)上比對工具BLAST進行查詢，確認所設計siRNA序列的唯一性。將所選擇的片段呈反向互補加到莖環(huán)序列的兩端，加上酶切位點后插入pGenesil-2質(zhì)粒，構建了表達Bmi-1 siRNA的重組真核表達載

3、體。2、采用脂質(zhì)體法將Bmi-1 siRNA表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進入Hela細胞，通過檢測Hela細胞中Neo基因的表達，來確定質(zhì)粒是否轉(zhuǎn)染到Hela細胞中，并利用熒光法觀察轉(zhuǎn)染效率。3、應用RT-PCR及Western blot方法檢測轉(zhuǎn)染后Bmi-1mRNA及Bmi-1蛋白的表達情況。4、應用MTT比色法、臺盼藍拒染法檢測Bmi-1 siRNA對Hela細胞增殖的抑制作用。5、利用流式細胞儀分析各組細胞的細胞周期。6、平板克隆形成實驗檢測B

4、mi-1 siRNA對Hela細胞的單細胞增殖能力的影響。7、在裸鼠腋窩將各組細胞進行皮下接種，觀察在裸鼠體內(nèi)Bmi-1 siRNA對Hela細胞致瘤能力的影響。8、應用Transwell實驗檢測Bmi-1 siRNA對Hela細胞體外遷移的影響。9、將各組細胞從尾靜脈注射到裸鼠體內(nèi)，觀察在裸鼠體內(nèi)Bmi-1 siRNA對Hela細胞轉(zhuǎn)移能力的影響。 結果：1、成功的構建了四條表達Bmi-1 siRNA的重組質(zhì)粒和一條陰性對照重

5、組質(zhì)粒。2、轉(zhuǎn)染后觀察熒光和Neo基因的表達情況證實重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染進入了Hela細胞中且轉(zhuǎn)染效率在90%左右。3、RT-PCR及Western blot結果顯示：各組Bmi-1 siRNA均能沉默Hela細胞中Bmi-1mRNA及Bmi-1蛋白的表達。4、MTT及流式細胞儀結果顯示：Bmi-1siRNA在體外能夠抑制Hela細胞的增殖；細胞周期阻滯于G0-G1期，使細胞增殖指數(shù)明顯下降。5、克隆形成實驗表明Bmi-1 siRNA明顯抑

6、制了Hela細胞的單細胞增殖能力。6、體內(nèi)成瘤實驗顯示Bmi-1 siRNA使Hela細胞在裸鼠體內(nèi)的致瘤能力明顯下降。7、Bmi-1 siRNA在體外能夠抑制Hela細胞穿過transwell小室的能力即遷移能力。8、Bmi-1 siRNA在裸鼠體內(nèi)能夠抑制Hela細胞的血道轉(zhuǎn)移能力。 結論：siRNA介導的Bmi-1基因的表達沉默，在體外抑制了Hela細胞的增殖和遷移能力，在裸鼠體內(nèi)抑制了Hela細胞的致瘤及轉(zhuǎn)移能力。Bmi