環(huán)境因素對(duì)心臟畸形胎兒影響的表觀遺傳學(xué)機(jī)制.pdf

1、心臟發(fā)育是一個(gè)高度復(fù)雜，時(shí)空協(xié)調(diào)的形態(tài)學(xué)發(fā)生過(guò)程，這個(gè)過(guò)程極易受外界環(huán)境干擾而導(dǎo)致心臟畸形的發(fā)生。80％的心臟畸形發(fā)生都有環(huán)境因素的參與。環(huán)境因素包括母親孕期外界接觸的環(huán)境，如有毒物質(zhì)的侵襲;還包括母親體內(nèi)微環(huán)境改變?nèi)缂膊顟B(tài)，母親孕期營(yíng)養(yǎng)元素缺乏。另外，環(huán)境在參與塑造穩(wěn)定的發(fā)育表型的同時(shí)，留下表觀遺傳學(xué)修飾標(biāo)記，這種表觀遺傳學(xué)修飾是可遺傳的，甚至在后代的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮一定的作用。因此我們推測(cè)胎兒心臟發(fā)育異常和表型改變與表觀遺傳學(xué)修飾改

2、變有關(guān)，我們分別選擇DNA甲基化修飾和microRNA作為我們研究心臟表觀遺傳學(xué)機(jī)制的載體，并從胎兒心臟異常發(fā)育和正常發(fā)育兩方面對(duì)表觀遺傳學(xué)修飾這個(gè)議題進(jìn)行剖析。
　　本課題中表觀遺傳學(xué)機(jī)制主要涉及DNA甲基化修飾和microRNA兩方面，具體內(nèi)容包括三部分，分別為:1）胎兒心臟畸形發(fā)生過(guò)程中DNA甲基化修飾的調(diào)控機(jī)制;2）孕期飲酒對(duì)胎鼠大腦、心臟組織以及胎盤(pán)組織印記基因甲基化狀態(tài)的影響。3）胎兒心臟正常發(fā)育過(guò)程中microRNA

3、的表達(dá)譜分析。
　　第一部分 胎兒心臟畸形發(fā)生過(guò)程中DNA甲基化修飾的改變
　　目的:研究心臟畸形胎兒心臟組織整體性甲基化狀態(tài)改變，及心臟發(fā)育相關(guān)基因的甲基化狀態(tài)與其表達(dá)的改變。
　　方法:共收集17例單純心臟畸形、14例復(fù)雜畸形合并心臟畸形和22例正常胎兒心臟組織進(jìn)行DNA抽提后亞硫酸氫鹽處理，采用Roche NimbleGen's全基因組甲基化芯片檢測(cè)5例心臟畸形（2例單純性心臟畸形和3例非單純性心臟畸形）和4例正

4、常對(duì)照胎兒心臟，獲得心臟畸形組織整體性甲基化水平改變情況;應(yīng)用Sequenom MassARRAY EpiTYPER定量甲基化分析平臺(tái)驗(yàn)證在15例單純心臟畸形、11例非單純心臟畸形與18例正常胎兒心臟組織中，10個(gè)心臟發(fā)育相關(guān)基因附近CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)分析:抽提7例單純性心臟畸形、7例正常胎兒心臟心臟組織總RNA抽提，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，同時(shí)抽提其蛋白，分別應(yīng)用定量real-time PCR和Westernblot檢測(cè)EGFR、SMA

5、D7、SLC19A1、NOTCH1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:心臟畸形胎兒心臟組織呈現(xiàn)整體性的低甲基化改變;在10個(gè)心臟發(fā)育相關(guān)基因附近甲基化位點(diǎn)中，心臟畸形（包括單純性和非單純性）胎兒心臟組織EGFR基因間、SMAD7基因內(nèi)、SLC19A1基因間CpG sites的甲基化水平升高，而NOTCH1基因內(nèi)CpG sites的甲基化水平降低;單純性心臟畸形組織中EGFR基因mRNA水平表達(dá)有下降趨勢(shì)，其編碼蛋白表達(dá)下降

6、，SMAD7基因mRNA水平有升高趨勢(shì)，其編碼蛋白表達(dá)升高，SLC19A1基因mRNA水平表達(dá)明顯降低(p=0.007)，蛋白表達(dá)也降低，NOTCH1基因mRNA水平表達(dá)有降低趨勢(shì)。
　　結(jié)論:心臟畸形胎兒心臟組織DNA甲基化水平的整體性降低和個(gè)別心臟發(fā)育相關(guān)基因CpG sites的甲基化水平改變及其基因表達(dá)的改變可能在心臟畸形的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮一定的調(diào)控作用。
　　第二部分 酒精暴露胎鼠心臟、大腦及胎盤(pán)組織印記基因Igf2/

7、H19甲基化差異區(qū)域甲基化狀態(tài)的分析及Igf2基因表達(dá)的改變
　　目的:研究酒精暴露對(duì)胎鼠心臟、大腦及胎盤(pán)印記基因Igf2/H19甲基化差異區(qū)域甲基化狀態(tài)和Igf2基因表達(dá)的影響。
　　方法:酒精灌胃處理孕6.5天至15.5天孕鼠，Sequenom MassARRAYEpiTYPER平臺(tái)檢測(cè)孕16.5天胎鼠心臟、大腦及胎盤(pán)組織印記基因Igf2/H19四個(gè)DMRs（差異甲基化區(qū)域differential methylation

8、 regions）甲基化狀態(tài)改變，定量RT-PCR檢測(cè)Igf2基因mRNA水平的表達(dá)。
　　結(jié)果:酒精暴露胎鼠心臟Igf2/H19印記基因DMR1的甲基化水平有改變，Igf2基因表達(dá)降低;大腦Igf2/H19印記基因DMR2的甲基化水平有改變，Igf2基因表達(dá)明顯升高;胎盤(pán)Igf2/H19印記基因H19 DMR甲基化水平有改變，Igf2基因mRNA水平表達(dá)也明顯高于對(duì)照組。
　　結(jié)論:酒精暴露影響胎鼠心臟、大腦及胎盤(pán)印記基因

9、Igf2/H19不同的DMR甲基化水平和Igf2基因的表達(dá)。
　　第三部分 胎兒正常心臟組織microRNA表達(dá)譜分析
　　目的:研究不同孕周胎兒心臟組織microRNA表達(dá)的時(shí)序性變化特點(diǎn)。
　　方法:收集5、7、9和23周齡正常胎兒心臟組織進(jìn)行RNA抽提，應(yīng)用AffymetrixmiRNA2.0芯片檢測(cè)四個(gè)時(shí)間點(diǎn)microRNA的表達(dá)譜;Rlimma軟件分析隨孕周變化表達(dá)發(fā)生改變的microRNAs; cluste

10、r3.0軟件聚類(lèi)分析microRNA表達(dá)的不同變化趨勢(shì);GO(gene ontology)功能富集分析經(jīng)網(wǎng)站預(yù)測(cè)microRNAs靶基因;定量real-time PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果。
　　結(jié)果:胎兒期心臟組織microRNAs的表達(dá)呈現(xiàn)5個(gè)不同的變化趨勢(shì)，大部分microRNAs被預(yù)測(cè)靶調(diào)控心臟發(fā)育相關(guān)因子的表達(dá)，參與心臟心腔、室間隔、流出道等解剖結(jié)構(gòu)的形成，和心臟發(fā)育相關(guān)的重要信號(hào)通路調(diào)控。另有7個(gè)miRNAs在胎兒心臟組織中的