仲景治療肺痿的辯證規(guī)律及相關(guān)實驗研究.pdf

1、特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis IPF)是指原因不明并以普通『自J質(zhì)性肺炎為特征性病理改變的一種慢性炎癥性間質(zhì)性肺疾病。 歷代醫(yī)家對于肺痿的認(rèn)識和治療方法對于肺痿的辨證論治具有重要意義，但是都散見于各代醫(yī)家著作之中，未經(jīng)系統(tǒng)總結(jié)歸納，本課題的理論研究將對歷代醫(yī)家和張仲景對肺痿的認(rèn)識和治療方法予以系統(tǒng)總結(jié)，旨在遵從前賢所淪的基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展，對某些混淆的問題予以闡述，探微索隱，為

2、能在臨床上更好的應(yīng)用祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)治療肺痿這種疑難重癥提供理論依據(jù)。 本課題的實驗研究追蹤該領(lǐng)域國際最新動態(tài)，與耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院合作，采用中藥復(fù)方加味桔梗湯，即桔梗湯加銀花、連翹、貫眾等藥物治療特發(fā)性肺纖維化模型小鼠，觀察加味桔梗湯對特發(fā)性肺纖維化模型小鼠的療效及對小鼠肺中骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4(Bone Morphogeneticprotein 4 BMP-4)的和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(Bone Morphogenetic protei

3、n 7 BMP-7)影響，探索特發(fā)性肺纖維化過程中加味桔梗湯對IPF小鼠的治療作用及其對BMP家族的調(diào)節(jié)作用，以及BMP-4、BMP-7在特發(fā)性肺纖維化模型小鼠肺中的含量變化，為在臨床上應(yīng)用經(jīng)方治療特發(fā)性肺纖維化提供實驗依據(jù)，并進一步探索中藥治療特發(fā)性肺纖維化的作用靶點。 1 理論研究 1.1系統(tǒng)總結(jié) 歷代醫(yī)家對肺痿的認(rèn)識及治療法則查閱自秦以降內(nèi)科、方劑、醫(yī)案醫(yī)話、雜著等古代中醫(yī)文獻，對其進行全面的分析、歸納和總

4、結(jié)，探討古代著名醫(yī)家辨治肺痿的經(jīng)驗，揭示古代中醫(yī)學(xué)在肺痿診治方面的規(guī)律和巨大成就。 1.2歸納總結(jié) 仲景治療肺痿的辨證規(guī)律“肺痿”病名首見于仲景之《金匱要略·肺痿肺癰咳嗽上氣病脈證治第七》，仲景對于肺痿的認(rèn)識及辨證方法，大多后人認(rèn)為止于《會匱要略》之條文，而其實在《傷寒雜病論》中，仲景對于喘證、咳嗽、短氣、虛勞的辨證方法，都可以運用于肺痿的辨證治療中。研究仲景治療肺痿的辨證規(guī)律，是為了拓寬《傷寒雜病論》中對肺痿的認(rèn)識及治

5、療范圍，為靈活的應(yīng)用經(jīng)方治療肺系疑難重癥提供理論依據(jù)。 2 實驗研究 2.1 加味桔梗湯對IPF模型小鼠的治療作用 生存率實驗取30只C57BL/6小鼠，將小鼠隨機分為中藥生存曲線組、平陽霉素生存曲線組，全部小鼠氣管內(nèi)滴注鹽酸平陽霉素造特發(fā)性肺纖維化小鼠模型，造模后，中藥生存曲線組小鼠每R予以加味桔梗湯灌胃，平陽霉素生存曲線組小鼠予以生理鹽水灌胃，觀察兩組小鼠的生存狀態(tài)及死亡情況。 結(jié)果表明，中藥生存曲線

6、組小鼠28天生存率為46％，平陽霉素生存曲線組小鼠28天生存率為13％，這說明加味桔梗湯對特發(fā)性肺纖維化模型小鼠有明顯的治療作用，為我們應(yīng)用具有清熱解毒的中藥復(fù)方治療特發(fā)性肺纖維化提供了一個整體性實驗依據(jù)。 2.2 IPF模型小鼠肺組織標(biāo)本病理觀察 實驗小鼠造模同支氣管灌洗實驗，在造模后第0天、1天、3天、5天、9天、14天、28天分別在平陽霉素組、加味桔梗湯組、生理鹽水組取8只小鼠的部分右肺，將小鼠肺組織標(biāo)本(右肺葉)

7、用10％福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，HE染色，觀察小鼠肺部病理變化。本實驗結(jié)果表明，加味桔梗湯對IPF模型小鼠有顯著的治療作用，加味桔梗湯組小鼠肺部的炎癥明顯較平陽霉素組小鼠輕，炎性細(xì)胞減少，在造模后第28天，加味桔梗湯組小鼠沒有出現(xiàn)肺部早期纖維化的趨勢。 2.3 IPF模型小鼠支氣管灌洗實驗 取200只C57BL/6小鼠，隨機分為三組，即生理鹽水組、平陽霉素組、加味桔梗湯組。生理鹽水組取C57BL/6小鼠60只，平陽

8、霉素組、加味桔梗湯組分別取C57BL/6小鼠70只。生理鹽水組小鼠不造模，平陽霉素組、加味桔梗湯組小鼠氣管滴注博萊霉素造特發(fā)性肺纖維化小鼠模型，在造模后第0天、1天、3天、5天、9天、14天、28天分別在平陽霉素組、加味桔梗湯組、生理鹽水組取8只小鼠，進行肺部病理變化肉眼觀察，并進行支氣管灌洗，于10倍顯微鏡下進行總細(xì)胞記數(shù)，Jamsa染色后進行中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞百分比記數(shù)。中性粒細(xì)胞是在早期急性肺損傷/肺胞炎階段的主要炎性

9、細(xì)胞。在造模后前五天，平陽霉素組、加味桔梗湯組的中性粒細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比都出現(xiàn)增高，與生理鹽水組比較都有非常顯著性差異，這說明，加味桔梗湯組和平陽霉素組在造模后早期都存在肺泡炎和肺部的損傷，從造模后第九天開始，平陽霉素組、加味桔梗湯組的中性粒細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比都趨于下降，加味桔梗湯組的中性粒細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比下降幅度較平陽霉素組占細(xì)胞總數(shù)的百分比下降幅度大，到第二十八天，平陽霉素組與生理鹽水組比較仍有顯著性差異，而加味桔梗湯

10、組與生理鹽水組比較沒有顯著性差異。說明加味桔梗湯促進了IPF小鼠肺部炎癥的吸收、感染的痊愈以及肺組織的修復(fù)。 在造模后，平陽霉素組、加味桔梗湯組的淋巴細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比都出現(xiàn)升高，平陽霉素組淋巴細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比從造模后第三天起呈逐漸增高的趨勢，到第九天時達到高峰，到第十四天后有所下降，但是與生理鹽水組比較仍有顯著性差異。加味桔梗湯組的淋巴細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比也出現(xiàn)增高，但從造模后第五天，加味桔梗湯組的淋巴細(xì)胞占

11、細(xì)胞總數(shù)的百分比又逐漸下降，到造模后第二十八天，與生理鹽水組相比較已經(jīng)沒有顯著性差異。淋巴細(xì)胞則是繼巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞之后出現(xiàn)的炎性細(xì)胞，但淋巴細(xì)胞在較長時間內(nèi)保持高水平狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)肺內(nèi)巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的增多先于淋巴細(xì)胞的浸潤也支持這一觀點。在本研究中也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)谄咛旆蝺?nèi)淋巴細(xì)胞浸潤達高峰時，成纖維細(xì)胞也明顯增多，而造模十四天后，隨著成纖維細(xì)胞的增多和膠原沉積的增加，肺內(nèi)炎性細(xì)胞的浸潤也以淋巴細(xì)胞為主，表明淋巴細(xì)胞與成纖維細(xì)胞

12、的增殖和膠原合成的增多有關(guān)。 2.4 ELISA法測IPF模型小鼠左肺組織BMP蛋白水平實驗 在造模后第0天、1天、3天、5天、9天、14天、28天分別取平陽霉素組、加味桔梗湯組、生理鹽水組8只小鼠的左肺，用酶聯(lián)接免疫吸附劑測定(Enzyme-Linked ImmunosorbnentAssay ELISA)方法測小鼠左肺組織BMP-4和BMP-7蛋白水平。實驗結(jié)果表明，平陽霉素組及加味桔梗湯組小鼠的BMP-7蛋白含量在

13、造模后五天內(nèi)與生理鹽水組小鼠相比較均呈下降趨勢，但加味桔梗湯組小鼠逐漸抑制住了BMP-7蛋白含量的下降趨勢，在第九天BMP-7蛋白含量開始回升，在第十四天基本恢復(fù)正常。而平陽霉素組的BMP-7蛋白含量一直趨于下降趨勢，到第二十八天與生理鹽水組比較仍有顯著性差異。但中藥治療沒有抑制住加味桔梗湯組小鼠BMP-4蛋白含量的下降趨勢，與生理鹽水組比較有顯著性差異。 2.5 RT-PCR法測IPF小鼠右肺BMPmRNA基因表達實驗

14、 在IPF小鼠造模后第0天、1天、3天、5天、9天、14天、28天分別取平陽霉素組、加味桔梗湯組、生理鹽水組8只小鼠的右肺，用RT-PCR方法測小鼠右肺組織BMP-4和BMP-7mRNA基因表達水平。實驗結(jié)果表明，加味桔梗湯組和平陽霉素組小鼠肺部BMP-4mRNA的基因表達都較生理鹽水組降低，從造模后開始呈持續(xù)性下降，說明中藥加味桔梗湯對特發(fā)性肺纖維化模型小鼠肺部BMP-4mRNA的基因表達沒有明顯的調(diào)節(jié)作用。 加味桔梗湯組和平

15、陽霉素組小鼠肺部的BMP-7mRNA的基因表達在造模后都較生理鹽水組出現(xiàn)降低，平陽霉素組小鼠肺部的BMP-7mRNA的基因表達從造模后開始呈持續(xù)性下降，加味桔梗湯組小鼠肺部BMP-7mRNA的基因表達在造模后也出現(xiàn)下降，但是從第五天開始出現(xiàn)緩慢的回升，這說明，中藥加味桔梗湯可以提高特發(fā)性肺纖維化模型小鼠肺部BMP-7mRNA的基因表達，BMP-7有可能是中藥治療特發(fā)性肺纖維化模型小鼠的作用靶點。 本課題的實驗研究從特發(fā)性肺纖維化

16、模型小鼠的生存狀態(tài)、肺部病理變化動態(tài)觀察、肺部BMP-4、BMP-7含量動態(tài)監(jiān)測幾個方面來研究加味桔梗湯對特發(fā)性肺纖維化模型小鼠的治療作用。通過以上實驗研究，可以得出以下結(jié)論 1 中藥生存曲線組小鼠28天生存率遠(yuǎn)高于平陽霉素生存曲線組小鼠，說明加味桔梗湯對特發(fā)性肺纖維化模型小鼠有顯著的治療作用。 加味桔梗湯組小鼠肺部的炎癥和肺損傷明顯較平陽霉素組小鼠輕，淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞滲出減少，在造模后28天，加味桔梗湯組小鼠沒有

17、出現(xiàn)肺部的纖維化。 3 IPF模型小鼠肺中BMP-4、BMP-7蛋白含量和mRNA基因表達均出現(xiàn)下降，中藥加味桔梗湯對IPF模型小鼠肺中的BMP-4的蛋白含量和mRNA基因表達沒有調(diào)節(jié)作用，但加味桔梗湯提高了IPF模型小鼠肺中BMP-7的蛋白含量和mRNA基因表達。說明中藥加味桔梗湯治療特發(fā)性肺纖維化的作用靶點有可能是BMP-7。 以上實驗結(jié)果都表明，中藥加味桔梗湯對IPF模型小鼠有治療作用，其作用機制是提高IPF模型小