雄黃微生物浸出液抗腫瘤作用研究.pdf

1、目前，隨著雄黃在腫瘤治療中的應用日益為人們所關注，它的水難溶解性所造成的制劑困難，提高其生物利用度，拓寬臨床應用等問題迫切需要解決。本研究采用微生物對雄黃進行生物浸出處理以提高其溶解度和生物利用度：利用實驗室分離的氧化亞鐵硫桿菌和或氧化硫硫桿菌制備雄黃的浸出液并對工藝進行系統(tǒng)的研究；以白血病K562和K562ADM細胞為模型，研究了雄黃的浸出液對腫瘤細胞增殖的影響及其誘導細胞凋亡的作用；采用毛細管電泳分析法對雄黃生物浸出液進行分離分析以

2、期確定它的藥效成分；對雄黃生物浸出液的急性毒性和藥物動力學進行考察。主要研究結(jié)果如下： 1．在有和沒有亞鐵離子的浸出體系下，氧化亞鐵硫桿菌、氧化硫硫桿菌制備雄黃的浸出液的最佳浸出條件為：30℃，pH 1.80，150轉(zhuǎn)/分，浸出時間30天。在浸出體系有鐵離子參與時，雄黃浸出液中砷的浸出率與無亞鐵離子的浸出體系的相比，有很大的提高。氧化亞鐵硫桿菌組雄黃浸出液中砷的浸出率，從10％迅速增長到43％；而氧化硫硫桿菌組僅從21％變化到2

3、3％；雄黃混合菌浸出液中砷的浸出率提高最快，從16％增加到56％只需20天。因此混合菌生物浸出雄黃是最佳工藝。通過電鏡掃描，能譜技術和X-射線衍射技術對細菌與雄黃作用的研究結(jié)果表明，混合菌作用雄黃是直接和間接作用的綜合結(jié)果。 2．為確證雄黃生物浸出液的生物效應，以相同濃度亞砷酸和常規(guī)粉體作為對照組，用噻唑藍(MTT)方法研究了三者對K 562和K562ADM細胞增殖的影響；應用激光共聚焦熒光顯微鏡、瓊脂糖凝膠電泳、流式細胞術及R

4、T-PCR技術研究其誘導細胞凋亡的作用。實驗結(jié)果表明雄黃浸出液可明顯抑制K562和K562ADM細胞生長，誘導細胞凋亡，具體表現(xiàn)為細胞體積縮小、細胞核的濃縮、典型的“DNAladder”電泳條帶和較高的凋亡率。細胞經(jīng)特異性抗體熒光標記，流式細胞術以及RT-PCR等研究，雄黃浸出液可使白血病細胞Fas和Caspase-3蛋白的表達的上調(diào)，bcl-2蛋白或p-gp蛋白的表達下調(diào)，這可能是雄黃微生物浸出液誘導K562和K562ADM細胞凋亡的

5、重要的分子機制。以上結(jié)果表明雄黃浸出液比原料雄黃表現(xiàn)出更強的細胞生長抑制和凋亡誘導效應，且在此過程中，雄黃浸出液可能是通過釋放可溶性砷，來發(fā)揮其誘導細胞凋亡的作用。 3．用毛細管區(qū)帶電泳法可以簡單，快速，有效的分析雄黃浸出液的四種砷類化合物(As<'Ⅲ>、iAs<'Ⅴ>、MMA<'Ⅴ>和DMA<'Ⅴ>)。采用優(yōu)化條件BGE:PDC/10mM與CTAOH/1mM分離條件：電壓25 kV、溫度25℃、pH 11.0、紫外檢測波長設定

6、在216nm。通過比較可以看出，雄黃浸出液與砷酸所含砷類化合物的種類部分相同(As<'Ⅲ>和iAs<'Ⅴ>)，其中混合菌浸出液與砷酸成分差異最大，同時含有三種砷化合物(As<'Ⅲ>和iAs<'Ⅴ>MMA<'Ⅴ>)。 4．急性毒性實驗表明：雄黃制備成雄黃浸出液后急性毒性增大。小鼠灌胃或小鼠腹腔半數(shù)致死量LD<,50>：雄黃氧化硫硫桿菌組毒性最大(0.0346±0.0030mg/ml)，其次為混合菌組(0.0737±0.0080 m

7、g/ml)，再次為氧化亞鐵硫桿菌組(0.2351±0.034 mg/ml)，然后才為亞砷酸(0.2656±0.0338 mg/ml)和常規(guī)粉體(83.701±0.6912 mg/ml)。從這一點上來講，雄黃中的溶解砷具有毒性與活性的雙向作用。按照劑量與LD50比值相同的原則，篩選毒性與亞砷酸相近的雄黃氧化亞鐵硫桿菌浸出液，適當調(diào)整浸出液的給藥劑量，進行藥物動力學研究，防止中毒反應發(fā)生，是非常有必要的。 5．雄黃制成氧化亞鐵硫桿菌

8、浸出液后，對砷在大鼠體內(nèi)的吸收和消除過程均有影響。雄黃常規(guī)粉體經(jīng)口服形式給藥，所含砷在大鼠心、肝、脾、肺、腦等組織的分布遠遠大于以腹腔注射雄黃浸出液和亞砷酸。雄黃亞鐵硫桿菌浸出液及亞砷酸組的AUC值分別比常規(guī)粉體的AUC值增加了294.38％和275.73％。經(jīng)過調(diào)整氧化亞鐵硫桿菌浸出液的給藥劑量后，雄黃的藥用劑量減少，其生物利用度大大提高，毒性降低，藥效提高。這就使得采用微生物對雄黃進行生物浸出處理以提高其溶解度和生物利用度的研究，具