慢性胃炎脾虛證患者基因差異表達圖譜研究.pdf

1、研究背景和目的20世紀50年代中期，一批名老中醫(yī)分別撰文，全面闡述和介紹了辨證論治體系，確立了辨證論治在整個中醫(yī)診療體系中的特殊地位。證在中醫(yī)理論中的獨特性和重要性得到了學術界的認同。隨之，對證候的研究、證本質的研究開始進行。到70年代中期，證本質研究進入了全面鋪開的時期。進入80年代后，研究逐步深入，如血瘀證、脾虛證、腎虛證等研究都進行得比較廣泛。 脾虛證作為中醫(yī)證侯研究中一個有代表性的領域，一直是中西醫(yī)結合研究的熱門課題之一

2、，被列入國家“七五”重點攻關項目和軍隊“七五”攻關課題。已進行的研究以消化系統(tǒng)為主，涉及免疫、能量代謝、肌肉運動、神經系統(tǒng)、內分泌、甚至基因水平等方面，取得了一定成就。 中醫(yī)理論認為脾主運化，運化水谷精微和水濕，脾主統(tǒng)血，脾為氣血生化之源，脾為后夭之本，四季脾旺不受邪，脾主思，脾主四肢肌肉，開竅于口，其華在唇等。脾的生理功能所涉及的廣泛性，就表明了脾的病理也不會局限于一病一癥一臟器。同時，脾與五臟六腑的關系，“內傷脾胃，百病由生

3、”等，說明脾胃損傷會引起很多疾病的發(fā)生，脾病會引起很多臟器系統(tǒng)的病變，而很多疾病、臟器病變也會引起脾病的發(fā)生。因此，脾虛證涉及的面也相當廣泛。它可以出現在內、外、婦、兒、腫瘤、皮膚、耳鼻喉、老年病等各科疾病中；它本身可以涉及到消化系統(tǒng)、神經系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、肌肉運動系統(tǒng)、內分泌系統(tǒng)、能量代謝系統(tǒng)等各個系統(tǒng)的方面的變化。對于這樣一個龐雜的體系，無序的研究只會造成混亂。任何單一方面的檢測指標也都只能反映宏觀概念中的一部分或某一點，而不可能是證

4、的全部。 為了使對脾虛證的研究進行的有序而深入，并最終形成一個綜合的輪廓，有必要采用病與證相結合的研究方法。在理論認識和已有的研究中，脾虛證可以出現在多個系統(tǒng)多種疾病的病變中，但一般以消化系統(tǒng)功能紊亂為主要表現的觀點得到大多數研究者的認同，而慢性胃炎是消化系統(tǒng)最常見的疾病，慢性胃炎患者有相當大的比例(有報道為1/3左右)可表現為脾虛。因此，我們的研究把范圍限定在慢性胃炎脾虛證，從而使研究的切入點更加明確，在臨床病例的入選上也更加

5、容易確定和甄別。 在已有的眾多參考指標中，從分子層面進行揭示的不多，深入到基因水平的更少。而隨著人類認識水平的提高，隨著遺傳學和分子生物學的發(fā)展，大量研究資料表明，人類許多疾病的發(fā)生發(fā)展都與某些相應的基因出現異常的擴增、重排、缺失、突變、功能異?；虮磉_異常有關；其中，基因表達水平的變化反映了機體特定階段的生命特征。研究表明不同的病或者證可能大多存在有其不同的基因組學基礎和背景。 目前國內許多專家比較認可的是，人類基因組學

6、的方法學內容與中醫(yī)整體觀、辨證觀有許多相似之處。脾虛證作為一系列復雜臨床癥狀和體征的集中描述，在這些表象背后，應該有其特定的生物學基礎。就是說，可能有支持它的相應基因組學背景，脾虛證可能具有相關基因的差異表達。本課題試圖描繪出脾虛證的基因差異表達圖譜。 在中醫(yī)證侯研究中，一直比較強調的一點就是，在對證的研究中要重視病與證的結合。脾虛證的研究亦是如此。因此，如前所述，我們的研究選擇了慢性胃炎作為研究對象，把研究的目標鎖定到慢性胃炎

7、脾虛證。同時，對中醫(yī)的同病異證的理論基礎進行探討，實驗選擇慢性胃炎的脾虛證和脾胃濕熱證進行對照研究，探討同一慢性胃炎兩種不同證型的基因表達差異。 研究方法1、病例選擇受試病例首先需要符合慢性胃炎診斷標準(臨床、胃鏡及病理診斷)，然后符合脾虛證/脾胃濕熱證辨證標準，同時要排除消化道器質性病變及其他系統(tǒng)嚴重病變者。 脾虛證辨證標準：主癥：①舌質淡、舌體胖或有齒印，苔薄白；②胃納減少或食欲差；③腹脹；④大便溏或腹瀉；次癥：①消

8、瘦；②體倦乏力；③脈細弱。判斷：1)主癥①必備。2)兼具主癥②、③、④之二；或兼具主癥②、③、④之一，同時兼具兩個以上次癥，診斷即可成立。 脾胃濕熱證辨證標準：主癥：①舌苔黃膩；②胸悶；③胃脘痞滿或脹痛；④食欲不振。次癥：①口苦而粘；②口渴而少飲，或喜熱飲；③大便溏，或有粘液；④惡心；⑤身困乏力；⑥脈濡緩，或滑。判斷：1)主癥①必備。2)兼具主癥②、③、④之二，或兼具主癥②、③、④之一，同時兼具兩個以上次癥；或兼具3個以上次癥，

9、診斷即可成立。 正常健康者選擇標準：臨床辨證無明顯異常，舌象脈象正常。胃鏡下及病理檢查胃粘膜無明顯病變者。 2、收集標本在廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院和廣東省中醫(yī)院按照上述標準收集慢性淺表性胃炎脾虛證患者作為試驗組(脾虛)，慢性淺表性胃炎脾胃濕熱證患者作為證型對照組(脾胃濕熱)，從志愿者中選擇健康人作為正常對照組(正常)。于廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院胃鏡室做胃鏡檢查。經胃鏡下診斷也符合納入標準后，胃鏡下鉗夾胃竇部和十二指腸

10、粘膜組織3至4塊，生理鹽水(RNase-free)清洗后，取一塊置于10％福爾馬林液中備做病理切片，其余于置于RNAlater中，液氮保存，以備制作表達譜芯片BiostarH-140s。 3總RNA提取將液氮保存的樣品用碾缽碾磨成粉末狀后，轉移至已經加入適量UNIzol試劑的勻漿管中勻漿。將勻漿液4℃，12000g，離心10min。小心吸取上清液，15～30℃放置5min。加入氯仿，震蕩，15～30℃放置3min，4℃，1200

11、0g，離心15min。吸取上清，加入異丙醇，充分混勻，15～30℃，放置10min，4℃，12000g，離心10min。棄去上清，緩慢加入75％乙醇5ml，洗滌，小心棄去乙醇。再加入75％乙醇10ml，短暫渦旋，4℃，8000g離心10min。小心棄上清，短暫離心，吸去上清，干燥沉淀5min。加入RNase-free的Milli-Q水，完全溶解RNA沉淀后，取適量RNA采用核酸定量分析儀和瓊脂糖凝膠電泳檢測質量，余-80℃保存。

12、 4探針標記按照UNIGENE芯片雜交試劑盒說明書操作如下：將配制好的預雜交液放入95℃水浴鍋內變性2min，將待預雜交的玻片放入95℃水浴鍋內變性30sec。將預雜交液加到玻片內，放入雜交箱內42℃預雜交5～6hr。依次加入以下試劑(反應終體積為50μl，以下試劑均為RNase-free)：23μlddH2O，5μl逆轉錄引物，30～50μg總RNA，振蕩混勻，置于70℃水浴10min。取出后，迅速置于冰上。分別加入以下試劑：10μl

13、逆轉錄酶緩沖液，5μlDTT，4μldNTPs。在暗室中加入以下試劑：2μl逆轉錄酶，脾虛加3μlCy5-dCTP(正常加3μlCy3-dCTP)，混勻樣品，手浴2min。42℃水浴2hr。依次加入標記試劑Ⅰ4μl，65℃水浴10min后加入標記試劑Ⅱ4μl?；靹?，合并對照組、實驗組。避光，真空抽干至50μk左右。純化DNA。加入標記試劑Ⅲ8μl，真空抽干。 5芯片雜交在抽干的探針管中加6.5μk雜交試劑Ⅰ，混勻。再加入6.5μ

14、k雜交試劑Ⅱ，混勻。將探針置于95℃水浴中變性2min；玻片置于95℃水浴中變性30sec，將探針置于芯片上，置于雜交艙中，42℃雜交過夜(16～18h)。 6洗片掃描用0.5％的洗滌液1沖洗玻片，將玻片依次浸入染色缸中洗滌10min。用0.5％的洗滌液1沖洗玻片，晾干。用ScanArray3000掃描儀掃描芯片，觀察雜交結果，用ImaGene3.0軟件分析Cy3和Cy5兩種熒光信號的強度和比值。 7芯片分析7.1對所有

15、基因的Cy5、Cy3熒光信號強度值和Cy5/Cy3的比值Ratio進行分析，設定判斷基因差異表達的標準為：(1)Cy5/Cy3的Ratio≥2，或≤0.5；(2)Cy3或Cy5信號值其中之一必須＞800；(3)6張芯片中至少有4張滿足條件(1)和(2)，即n≥4。滿足三個條件的基因即為兩組標本之間的基因差異表達圖譜。 7.2對篩選出的差異表達基因進行聚類分析 7.3比對兩組實驗篩選出的差異表達基因，尋找兩組結果中一致的基

16、因 7.4對篩選出的差異表達基因，取其在所有芯片的熒光值做t檢驗，計算均值和標準差，p＜0.05為有表達差異的基因，p＜0.01為顯著表達差異的基因。 8RealtimePCR綜合芯片分析結果，對顯著表達差異的基因，進行熒光定量PCR檢測其表達水平。 結論1、慢性胃炎脾虛證與正常健康人比較，存在有胃粘膜基因差異表達特征圖譜。主要包括與代謝、蛋白質生物合成、蛋白質運輸、免疫、平滑肌運動、信號傳導等相關的基因。

17、 2、慢性胃炎脾虛證與慢性胃炎脾胃濕熱證比較，存在有胃粘膜基因差異表達特征圖譜。主要包括與消化吸收相關酶、炎癥、生長發(fā)育、細胞周期等相關的基因。 3、經熒光定量PCR技術對部分基因芯片技術篩選出的差異表達基因的再檢測，與芯片結果有一定的復合度(61.8％)。 4、實驗結果提示脾虛證存在有差異表達基因組學背景，可以作為脾虛證臨床研究和證本質研究的參考。發(fā)現的若干基因可以進一步進行蛋白表達等方面的深入研究。實驗病例入選標準