慢性胃炎脾虛證消化吸收障礙亞型差異表達(dá)基因生物信息學(xué)及臨床研究.pdf

1、研究背景和目的: 本研究擬重復(fù)我們第一批慢性胃炎脾虛證基因差異表達(dá)譜的實(shí)驗(yàn)工作，考證兩批慢性胃炎脾虛證芯片差異表達(dá)基因的重復(fù)性及差異性，并在此基礎(chǔ)上通過對(duì)證候癥狀體癥及基因芯片差異表達(dá)基因及其編碼蛋白功能的生物學(xué)信息分析，描繪出脾虛消化吸收障礙亞型差異表達(dá)基因的病理生理背景的假設(shè)，進(jìn)一步完善脾虛消化吸收障礙亞型診斷標(biāo)準(zhǔn)。 研究方法： 1、病例選擇 受試病例首先需要符合慢性胃炎診斷標(biāo)準(zhǔn) (臨床、胃鏡及病理診

2、斷)，然后符合脾虛證／脾胃濕熱證辨證標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)要排除消化道器質(zhì)性病變及其他系統(tǒng)嚴(yán)重病變者。 2、收集標(biāo)本: 在廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院和廣東省中醫(yī)院按照上述標(biāo)準(zhǔn)收集慢性淺表性胃炎脾虛證患者作為試驗(yàn)組 (脾虛)，慢性淺表性胃炎脾胃濕熱證患者作為同病異證證型對(duì)照組(脾胃濕熱)，從志愿者中選擇健康人作為正常對(duì)照組(正常)。參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì)2000年井崗山會(huì)議標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)胃鏡和病理活檢確診，排除心、肝、脾、肺、腎系等疾患

3、。于(早8:30—11:00)經(jīng)胃鏡下診斷也符合納入標(biāo)準(zhǔn)后，胃鏡下鉗夾胃竇部(距幽門口2-3cm)粘膜組織4至5塊，取1-2塊置于10％福爾馬林液中備做病理切片，其余馬上置于RNAlATER中，液氮保存，以備制作表達(dá)譜芯片BiOstarH-140s。 結(jié)果: 1、受試者收集情況 共收集慢性胃炎49例 (全部取胃粘膜)，來源于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院和廣東省中醫(yī)院門診病人；其中脾虛證病人 21例，男7例，女14例

4、，年齡20-57歲，平均年齡 33.9歲，病程3個(gè)月-10年以上；慢性胃炎濕熱證病人28例，男11例，女17例，年齡19-58歲，平均年齡37.8歲，病程3個(gè)月-10年以上；14例正常人胃粘膜無明顯病變，基本情況為：男2例，女12例，年齡22～27歲，舌質(zhì)淡、苔薄白，脈弦或緩。經(jīng)過RNA提取后進(jìn)一步篩選，選擇RNA提取質(zhì)量好的病例納入芯片研究，各組分別選出8例病人進(jìn)行配對(duì)芯片研究。 2、胃粘膜組織病理學(xué)觀察 入選病例病理

5、切片觀察，慢性胃炎脾虛組和脾胃濕熱組胃粘膜多出現(xiàn)中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞或漿細(xì)胞的浸潤(rùn)，只是程度各不相同，正常人病理切片觀察多無明顯異常，均符合實(shí)驗(yàn)的納入標(biāo)準(zhǔn)。 3、臨床資料分析 3.1 慢性胃炎臨床癥狀及病理分析：慢性胃炎HP與舌苔有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.015)，薄白苔者HP陽性率較低(4/17)，而黃膩苔者HP感染率最高(13/17)。HP與性別、病程及病理無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但隨著病程的延長(zhǎng)及病理的加重，HP 的感染率增加，

6、以上情況可能與樣本量有關(guān)。隨著病理炎癥程度的加重，腹痛的機(jī)率相應(yīng)增加，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與樣本量有關(guān)，也有可能表明炎癥并不是引起腹痛的唯一原因，與個(gè)體的耐受性、飲食、情緒等多種因素相關(guān)。另外，慢性胃炎舌體胖大與便溏具有相關(guān)性，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tau b=0.384，P=0.007)。 3.2 慢性胃炎脾胃濕熱證與脾虛證患者臨床資料分析：慢性胃炎脾胃濕熱證與脾虛證患者在男女比例、病程、病理程度上無顯著差異，在痞滿及腹痛癥狀上

7、有顯著差異，脾虛證患者以痞滿為主(13/21，62％)，脾胃濕熱證患者腹痛多見(22/28，79.8％)：慢性胃炎脾胃濕熱證與脾虛證患者在HP感染及食少納呆上有顯著差異，脾胃濕熱證HP 感染率明顯高于脾虛證(P=0.019)，脾虛患者食少現(xiàn)象高于脾胃濕熱證(P=0.005)。 3.3.1 慢性胃炎脾虛證臨床癥狀出現(xiàn)頻率：出現(xiàn)率在90％以上的有舌淡有齒痕、食后腹脹、體倦乏力、納呆等4個(gè)癥狀；作為辨證標(biāo)準(zhǔn)主癥的便溏出現(xiàn)頻率只有47.

8、6％，提示便溏可能在脾虛證發(fā)展到一定程度才會(huì)出現(xiàn)；另外提取出現(xiàn)頻率在45％以上的臨床癥狀，按主次癥積分對(duì)脾虛證的輕重程度進(jìn)行劃分。主癥仍按照已有的慢性胃炎脾虛證的診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。劃分原則兼顧定性、定量評(píng)分。其中主次癥綜合分≤5為正常人，≤10 為脾虛輕度，≤為15中度，>15為重度；脾虛主癥(舌淡有齒痕、食后腹脹、食少納呆、便溏)分值高的病人往往伴有次癥 (如消瘦、體倦乏力、神疲懶言、失眠等全身癥狀)分值的增高，主、次癥得分合計(jì)較高；此外

9、，本組脾虛證患者以輕、中度居多，重度較少。 3.3.2 脾虛癥狀與慢性胃炎脾虛證程度的關(guān)系：便溏、神疲懶言在脾虛程度的劃分上有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.017，P=0.030)，對(duì)中至重度脾虛的診斷有參考意義，而舌體胖大(P=0.069)及消瘦(P=0.067)在脾虛證分度診斷中雖未統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與樣本量小有關(guān)，但是也呈現(xiàn)出了隨著脾虛程度的加重，此兩項(xiàng)癥狀出現(xiàn)的頻率增高的現(xiàn)象，在重度脾虛證患者中此兩項(xiàng)癥狀出現(xiàn)率最高，也說明脾虛證程度

10、演變過程是從消化道癥狀逐漸向全身癥狀發(fā)展的過程。慢性胃炎脾虛證患者脘腹痞滿的頻率 (13/2l，61.9％)略高于脘腹疼痛 (8/21，38.1％)者。脾虛證失眠與性別無關(guān)，體重減輕與便溏無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，造成體重減輕的原因較多，如納少、勞累等，但是體重減輕與失眠有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(tau b=0.748，P=0.001)，分析原因可能是體重減輕的患者多屬于中重度脾虛患者，脾主運(yùn)化水谷，脾虛失運(yùn)，納食減少，消化吸收障礙，氣血生化乏源，血不養(yǎng)心，以

11、致失眠。 4、基因芯片分析 4.1 慢性胃炎脾虛證與正常組芯片的Ratio值及生物信息學(xué)分析 計(jì)算本配對(duì)組8張芯片中每張芯片上14112點(diǎn)基因探針的Cy5/Cy3的Ratio比值，按照上述所設(shè)條件進(jìn)行分析，得出脾虛證與正常人胃粘膜的差異表達(dá)基因共83條。脾虛證與正常人比較，上調(diào)24條(28.9％)，下調(diào)51條(61.4％)，上下調(diào)趨勢(shì)不明顯9條(8.6％)。經(jīng)檢索互聯(lián)網(wǎng)生物學(xué)公共數(shù)據(jù)庫 GeneBank，獲得每條

12、基因的名稱和其他基本信息。 4.2 t-test分析對(duì)“4.1”方法篩選出的83條基因進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果有12條基因熒光值的差異滿足P<0.05。 對(duì)“4.2”方法篩選出的294條基因進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果有109條基因熒光值的差異滿足 P<0.05，其中下調(diào)85條(77.98％)，上調(diào)24條(22.02％)。 4.3、聚類分析(分析基因或樣本之間的相互關(guān)系) 4.4.1 慢性胃炎脾虛證與正常組芯片的基因聚類分析

13、基因聚類分析是通過建立各種不同的數(shù)學(xué)模型，她把基于相似數(shù)據(jù)特征的變量組合在一起，歸為一個(gè)簇的基因在功能上可能相關(guān)或關(guān)聯(lián)，從而找到未知基因的功能信息或以知基因的未知功能，但是由于使用數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換、歸一化等因素，導(dǎo)致對(duì)聚類分析結(jié)果的影響較大；此外，聚類只是為了尋求類，不管所聚類別是否有意義，故需結(jié)合基因的生物信息學(xué)進(jìn)行判讀。脾虛證與正常組8張芯片篩選出的83條差異表達(dá)基因基本可歸為5大類(具體內(nèi)容見論文)。 4.4.2 脾虛證病例的聚類

14、分析 在進(jìn)行樣本聚類時(shí)采用所有差異基因進(jìn)行聚類，探討聚類結(jié)果的差異性。 4.4主要差異表達(dá)基因的基因庫生物信息資料在兩批芯片實(shí)驗(yàn)中與蛋白質(zhì)合成、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收、能量代謝、細(xì)胞骨架及細(xì)胞周期相關(guān)基因下調(diào)。 以上結(jié)果表明慢性胃炎消化吸收障礙亞型患者有其相應(yīng)的基因背景。 結(jié)論: (1)慢性胃炎脾虛證消化吸收障礙亞型有其差異基因表達(dá)圖譜，主要表現(xiàn)為蛋白質(zhì)合成代謝、能量代謝及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收、細(xì)胞周期及細(xì)胞骨架相

15、關(guān)基因的下調(diào)，尤其是蛋白質(zhì)合成場(chǎng)所的相關(guān)基因核糖體蛋白表現(xiàn)集中，將是下一階段研究的重點(diǎn)；兩批芯片在差異基因的上下調(diào)趨勢(shì)比例及基因分類上有較高的一致性，說明診斷標(biāo)準(zhǔn)的可行性、證的穩(wěn)定性及一定范圍內(nèi)的特異性，但是完全重復(fù)且上下調(diào)趨勢(shì)一致的基因較少，除了考慮兼夾證、個(gè)體差異、時(shí)空差異之外，證候的輕重程度分級(jí)也應(yīng)加以考慮。 (2)證候有以候?yàn)樽C的特點(diǎn)，不同癥狀群應(yīng)有相應(yīng)的基因背景，證候的臨床表征和現(xiàn)代生物學(xué)基礎(chǔ)是一個(gè)統(tǒng)一體的兩個(gè)方面，證

16、候的科學(xué)研究，必須緊抓住這兩個(gè)基本要素。通過對(duì)脾虛消化吸收障礙亞型患者臨床資料的總結(jié)分析，發(fā)現(xiàn)次癥體倦乏力分布頻率靠前，而在基因表達(dá)中有與線粒體能量代謝相關(guān)基因下調(diào)，是否納入主癥范疇有待進(jìn)一步商榷。主癥便溏分布頻率只有47％，但與中重度脾虛患者比例明顯升高，有顯著的相關(guān)性及統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，舌體胖大與脾虛程度雖無顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但呈現(xiàn)出正比的關(guān)系，且舌體胖大與便溏有較高的相關(guān)性及統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故認(rèn)為此兩種癥狀體征可作為脾虛消化吸收障礙亞型程度

17、分級(jí)的參考指標(biāo)，而在對(duì)差異基因基礎(chǔ)上的脾虛患者樣本聚類時(shí)亦可發(fā)現(xiàn)舌體胖大及便溏患者其綜合評(píng)分高，這些樣本被明顯的聚在一起，此類樣本與消化吸收相關(guān)的基因下調(diào)趨勢(shì)及比例較明顯。 (3)證候由于其定位不明確、非定量、涉及多系統(tǒng)、主次癥組合辨證的特點(diǎn)，從大范圍來研究證候的特異性客觀化指標(biāo)是不現(xiàn)實(shí)的，應(yīng)在某一特定的范圍內(nèi)選擇具有典型癥狀表現(xiàn)的病例進(jìn)行研究才會(huì)有一定的實(shí)際意義。 (4)本次基因芯片實(shí)驗(yàn)只是從另一個(gè)角度研究證候，其得出