重組腺相關病毒介導的抑制轉錄因子ROG對支氣管哮喘的防治作用研究.pdf

1、目的 1.建立可長期培養(yǎng)的抗原特異性的Th1/Th2克隆及細胞系。 2.克隆小鼠ROG基因，構建表達ROG的重組腺相關病毒載體pAAV-ROG，制備表達ROG的重組腺相關病毒rAAV-ROG，研究rAAV-ROG對哮喘的保護作用。 方法 用卵蛋白(OVA)免疫Balb/c小鼠，10-14d后取淋巴結細胞在體外用同系脾細胞和OVA反復刺激，然后分別用IL-2、IFNγ及IL-2、IL-4共同培養(yǎng)，并同時加入

2、同系脾細胞和OVA，進行Th1和Th2克隆的誘導，并通過有限稀釋法進行克隆化培養(yǎng)。對克隆化的細胞用ELISPOT技術檢測其分泌細胞因子的特性。 設計、合成引物，通過RT-PCR法從CTLL-2細胞總RNA中擴增ROG基因，測序成功后，最終連接于pAAV-MCS，雙酶切、PCR鑒定陽性重組質粒，并在Hela細胞中表達，測序鑒定其正確性；大量制備pAAV-ROG、pAAV-RC、pHelper、pAAV-LacZ質粒，并調整質粒濃度

3、到1μg/μl。應用DMEM高糖培養(yǎng)基，AAV-293細胞超過50％傳代；培養(yǎng)AAV-293細胞使之達到70-80％融合用于轉染。轉染方法采用磷酸鈣法，分六組，A組：不加DNA；B組：pAAV-ROG、pAAV-RC、pHelper各10μg共轉染AAV-293細胞。C組和D組：分別取pAAV-rhGFP和pAAV-LacZ取代pAAV-ROG，與pAAV-RC、pHelper為對照。E組和F組：分別為不加pAAV-RC、pHelper

4、，其它操作均同B。鏡下觀察病毒顆粒的產生及培養(yǎng)基的變化。轉染后6小時換新鮮培養(yǎng)基，72h收集細胞及培養(yǎng)基置于離心管中，將離心管交替置于干冰及37℃水浴中各10分鐘，交替4次后室溫離心，取上清-80℃凍存。進一步濃縮采用無水乙醇法。用Hela細胞通過測定對照rAAV-LacZ的病毒滴度間接確定rAAV-ROG、rAAV-rhGFP的滴度。 制備小鼠支氣管哮喘模型：應用卵蛋白，動物用Balb/c鼠，雌性，體重25-30mg，隨機分為

5、3組，A組：以PBS代替OVA激發(fā)與致敏；B組和C組均用OVA致敏和激發(fā)，但B組用重組腺相關病毒處理；C組以PBS處理。按初免劑量10μg/次/鼠(時間1d、8d、15d)，激發(fā)劑量10μg/次/鼠(時間26d、27d、28d)的方案制備小鼠支氣管哮喘模型。B組在初免的第2周經鼻滴入50μL重組腺相關病毒溶液，C組予以相同體積的PBS溶液；于29d分批對小鼠進行肺泡灌洗，研究肺泡灌洗液中細胞數(shù)的變化；同時肺組織行HE染色和免疫組化檢查。

6、各組數(shù)值以均數(shù)±標準差表示，采用完全隨機設計資料均數(shù)的t檢驗。以p＜0.05為差異顯著。 結果 共獲得了5個Th1/Th2細胞克隆，它們分泌不同的細胞因子；H-2d限制性分析表明這些T細胞僅在以Balb/c小鼠的脾細胞作為抗原遞呈細胞時才對OVA產生應答；不同抗原刺激表明，所獲得的T細胞僅對OVA產生特異性應答，而其它抗原刺激后增殖反應不明顯；ELISPOT分析表明，加入不同誘導因素的克隆分別表達較高水平的IFNγ和IL

7、-4。 成功擴增了小鼠ROG基因，經測序證明其與Genebank上的序列一致；構建可表達ROG基因的重組腺相關病毒載體pAAV-ROG。轉染AAV-293細胞3天后，100×普通光學顯微鏡下可見A組細胞貼壁完整，培養(yǎng)液呈紅色；B組細胞變圓，并懸浮，培養(yǎng)液的顏色呈橘黃色；C、D組細胞同B組；C組在熒光顯微鏡下可見到綠色熒光表達；E、F組細胞表現(xiàn)與A組相似。獲得純化病毒的滴度為2×1011/ml。用卵蛋白復制小鼠支氣管哮喘模型；應用