內(nèi)源性一氧化氮合酶抑制物與內(nèi)皮細(xì)胞通訊功能障礙及（口山）酮的保護(hù)作用.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是冠心病發(fā)病的主要原因，目前研究認(rèn)為血管內(nèi)皮受損在AS發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。一氧化氮(NO)主要由NO合酶(NOS)催化L-精氨酸轉(zhuǎn)化而來(lái)，在維持血管結(jié)構(gòu)和功能中起重要作用，被認(rèn)為是一個(gè)關(guān)鍵的內(nèi)源性抗AS分子。 近期研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)存在內(nèi)源性NOS抑制物非對(duì)稱二甲基精氨酸(ADMA)，能減少NO合成，進(jìn)而損傷內(nèi)皮功能。ADMA還能誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和炎癥因子生成，促進(jìn)內(nèi)皮損傷等，可能是一個(gè)新的內(nèi)源性致AS分子。二甲基

2、精氨酸一二甲胺水解酶(DDAH)是ADMA的代謝酶，其活性下降是體內(nèi)ADMA累積的主要原因?？寡趸幘S生素E、普羅布考等的抗AS作用與增加DDAH活性，降低ADMA水平有關(guān)，提示DDAH/ADMA通路可能是AS防治的新靶點(diǎn)。 本論文在細(xì)胞和動(dòng)物水平系統(tǒng)探討了ADMA致內(nèi)皮功能不全的作用機(jī)制、DDAH/ADMA通路在AS形成和防治中的作用及抗氧化藥物口山酮的抗AS作用。 第一章ADMA促動(dòng)脈粥樣硬化作用的研究 第一

3、節(jié)ADMA促動(dòng)脈粥樣硬化形成的作用研究背景研究顯示，間隙連接通訊(CJIC)功能改變?cè)贏S發(fā)病機(jī)制中具有一定意義。GJ由細(xì)胞質(zhì)膜上的蛋白質(zhì)亞單位—間隙連接蛋白(Cxs)相互銜接而成。血管內(nèi)皮的自穩(wěn)態(tài)及生理功能的維持，都依賴于內(nèi)皮GJIC介導(dǎo)的信息交換和協(xié)同反應(yīng)。研究表明，Cx43的表達(dá)、空間分布及結(jié)構(gòu)變化以及其引起的GJIC功能變化可能在AS發(fā)病機(jī)制中具有一定意義。對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞GJIC功能和Cx43表達(dá)的影響是多種AS危險(xiǎn)因素致內(nèi)皮功能不

4、全的機(jī)制。 大量研究表明，多種因素均可通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)氧自由基生成，氧化Cx或者改變其所在膜環(huán)境誘發(fā)Cx構(gòu)象改變，導(dǎo)致GJIC功能障礙?；谘趸瘧?yīng)激是導(dǎo)致GJIC功能障礙的重要原因以及內(nèi)源性ADMA能誘發(fā)氧化應(yīng)激，推測(cè)ADMA可能通過(guò)致氧化作用氧化Cx43導(dǎo)致GJIC功能障礙，進(jìn)而促進(jìn)AS發(fā)生發(fā)展。 方法:實(shí)驗(yàn)設(shè)4組(n=8)：①野生型C57BL/6J小鼠組；②野生型C57BL/6J小鼠外源性ADMA處理組；@ApoE基因

5、缺陷(ApoE<'-/->)小鼠組；④ApoE<'-/->小鼠外源性ADMA處理組。ADMA(5 mg/kg)每日皮下注射。4周后，眼眶取血，離心，分離血漿，檢測(cè)血漿對(duì)氧磷酶(PON1)活性、ADMA(HPLC法)濃度；開(kāi)胸，迅速分離主動(dòng)脈，觀察動(dòng)脈粥樣損傷(蘇丹紅染色法)及主動(dòng)脈內(nèi)皮Cx43蛋白表達(dá)(免疫組化法)。 結(jié)論:ADMA是AS形成的重要促進(jìn)物，其作用可能與下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞Cx43表達(dá)，進(jìn)而抑制間隙連接細(xì)胞間通訊功能有關(guān)。

6、 第二節(jié) NADPH氧化酶介導(dǎo)溶血性磷脂酰膽堿誘發(fā)的ADMA升高 背景:內(nèi)皮功能紊亂與氧化應(yīng)激密切相關(guān)。活性氧(ROS)在氧化應(yīng)激中起重要作用。NADPH氧化酶途徑是內(nèi)皮細(xì)胞活性氧的重要來(lái)源。研究表明，內(nèi)皮細(xì)胞增殖及凋亡，缺氧/復(fù)氧損傷和NO介導(dǎo)的內(nèi)皮舒張功能障礙均涉及NADPH氧化酶活性變化。 ADMA與血管內(nèi)皮功能密切相關(guān)。多種刺激因素包括氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)均可誘導(dǎo)ADMA生成。已知溶血性磷脂

7、酰膽堿(LPC)是ox-LDL的主要成分，能誘導(dǎo)ADMA生成，并能激活NADPH氧化酶誘發(fā)氧化應(yīng)激。因此，本實(shí)驗(yàn)探討了LPC誘導(dǎo)的ADMA升高是否通過(guò)NADPH氧化酶途徑誘發(fā)氧化應(yīng)激，進(jìn)而影響ADMA代謝酶活性而發(fā)揮作用。 方法:將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC-12)分為：正常對(duì)照組；LPC(10mgm)損傷組；LPC+NADPH氧化酶抑制劑DPI(100和300 μM)組；LPC+黃嘌呤氧化酶抑制劑別嘌呤醇(100μM)組。L

8、PC處理前1 h加入藥物，細(xì)胞培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間后，收集細(xì)胞，提取蛋白，檢測(cè)PRMTI表達(dá)(Western blot)、DDAH活性(HPLC法)及細(xì)胞內(nèi)ROS水平(熒光法)；收集細(xì)胞培養(yǎng)液，測(cè)定NO(Griess法)和ADMA(HPLC法)濃度；MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性。 結(jié)論:LPC誘發(fā)ADMA水平增高與其升高NADPH氧化酶活性，進(jìn)而上調(diào)PRMT表達(dá)及降低DDAH活性有關(guān)。 第三節(jié) ADMA對(duì)細(xì)胞通訊功能的影響 背景

9、:內(nèi)皮細(xì)胞功能完整性的維持需要各個(gè)細(xì)胞間活動(dòng)的高度協(xié)調(diào)，GJIC在其中發(fā)揮重要作用。在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞主要表達(dá)Cx43。研究發(fā)現(xiàn)，AS發(fā)生發(fā)展與內(nèi)皮細(xì)胞間GJIC功能缺陷密切相關(guān)，Cx43的表達(dá)、空間分布以及結(jié)構(gòu)變化對(duì)AS具有重要調(diào)控作用。 LDL是促進(jìn)AS斑塊發(fā)生的主要脂質(zhì)成分，可誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)的改變。LDL所誘發(fā)的內(nèi)皮功能不全中，ADMA起重要介導(dǎo)作用。研究發(fā)現(xiàn)，LDL所致內(nèi)皮細(xì)胞問(wèn)GJIC功能改變可能是其致AS的重

10、要機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平觀察了LPC對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞GJIC功能和Cx43表達(dá)的影響。體內(nèi)90％以上ADMA經(jīng)組織細(xì)胞中DDAH代謝。DDAH存在DDAH1和DDAH2兩種亞型，其中DDAH2主要分布于表達(dá)內(nèi)皮型NOS和誘導(dǎo)型NOS的血管組織，是心血管系統(tǒng)ADMA的主要代謝酶。我們利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，建立了過(guò)表達(dá)DDAH2的內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)一步探討了DDAH/ADMA通路在LPC所致GJIC功能和Cx43表達(dá)改變中的作用。 方法:

11、 (1)LPC對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞GJIC功能的影響及DDAH/ADMA通路的作用在正常細(xì)胞、空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞及DDAH2過(guò)表達(dá)細(xì)胞，分別設(shè)立空白對(duì)照組；LPC處理組，加入LPC(10 mg/L)孵育內(nèi)皮細(xì)胞24 h；LPC+NADPH氧化酶抑制劑diphenyliodioum(DPI，100μM)組；LPC+黃嘌呤氧化酶抑制劑別嘌呤醇(100μM)組。 (2)ADMA調(diào)節(jié)GJIC及Cx43表達(dá)的機(jī)制用不同濃度ADMA處理內(nèi)皮細(xì)胞

12、不同時(shí)間，觀察Cx43表達(dá)變化。 結(jié)論:DDAH/ADMA通路介導(dǎo)了LPC對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞GJIC及Cx43的調(diào)節(jié)作用，其機(jī)制可能涉及活性氧-p38MAPK途徑。 第二章口山酮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用及其機(jī)制研究 背景:LDL所致內(nèi)皮細(xì)胞間GJIC功能改變可能是其致AS的重要機(jī)制。LDL及其氧化產(chǎn)物可以劑量依賴性抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞GJIC功能。近年實(shí)驗(yàn)表明，AS等多種心血管疾病血管功能不全與ADMA水平升高

13、有關(guān)。LDL及ox-LDL是AS時(shí)ADMA濃度升高的主要原因，并且ADMA濃度升高也是LDL致內(nèi)皮功能不全的重要介導(dǎo)因素。多種藥物通過(guò)降低ADMA濃度可拮抗LDL及ox-LDL的作用。 第一節(jié)口山酮對(duì)高膽固醇血癥大鼠血脂的影響 方法:實(shí)驗(yàn)分預(yù)防性給藥和治療性給藥兩部分。在預(yù)防性給藥實(shí)驗(yàn)，提前兩天給予大鼠三個(gè)劑量口山酮(10、30和90 mg/kg)，然后再灌以高膽固醇乳劑，連續(xù)十天；在治療性給藥實(shí)驗(yàn)，給予大鼠高脂飲食一個(gè)

14、月后，再按血脂水平將高膽固醇大鼠隨機(jī)分組，給予不同劑量口山酮(10、30和90 mg/kg)，連續(xù)3周。末次給藥后禁食12 h，取血檢測(cè)血脂及丙二醛水平。 結(jié)論:口山酮可降低高膽固醇血癥大鼠血脂水平，此作用可能與其抗氧化作用有關(guān)。 第二節(jié)口山酮對(duì)Cx43表達(dá)的影響及機(jī)制 方法: 1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)分4組(n=8)：①野生型C57BL/6Jdx鼠組；②ApoE<'-/->小鼠組；③低劑量口山酮組，給予ApoE

15、<'-/->小鼠口山酮(10 mg/kg)；④高劑量口山酮組，給予ApoE<'-/->小鼠口山酮(20 mg/kg)。口山酮每日灌胃給藥。4周后，眼眶取血，分離血漿，檢測(cè)血漿PONl活性、血脂和ADMA(HPLC法)濃度；分離主動(dòng)脈，觀察動(dòng)脈粥樣損傷(蘇丹紅染色法)及Cx43表達(dá)(免疫組化)。 2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組；LPC處理組：LPC(10 mg/L)孵育內(nèi)皮細(xì)胞相應(yīng)時(shí)間；LPC+不同劑量3，4，5，6-