線粒體一氧化氮合酶在敗血癥休克性心功能抑制中的作用研究.pdf

1、近幾十年來，隨著醫(yī)學的發(fā)展，診療手段得到明顯的改進和發(fā)展，但是敗血癥休克仍保持著較高的發(fā)病率和死亡率。 在敗血癥休克過程中，機體釋放大量體液因子，如白細胞介素、腫瘤壞死因子等，這些活性因子均能誘導一氧化氮(nitricoxide，NO)的過量生成，而過量生成的NO被認為是引起敗血癥休克全身持續(xù)性低血壓狀態(tài)的重要原因。 體內一氧化氮主要是由一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase，NOS)催化L-精氨酸生成的。

2、現(xiàn)己公認的NOS主要有三種：誘導型NOS(inducibleNOS，iNOS或NOS2)、內皮型NOS(endothelialNOS，eNOS或NOS3)和神經(jīng)型NOS(neuronalNOS，nNOS或NOS1)。其中eNOS與nNOS合稱為固定表達型NOS(constitutiveNOS，cNOS)。1997年，由Ghafourifar和Richter發(fā)現(xiàn)在線粒體上存在一種有別于以上三種的NOS，稱之為線粒體NOS(mitochon

3、drialNOS，mtNOS)。我們認為，mtNOS作為細胞內一種新型NOS，有必要闡明其在敗血癥休克病程中的作用。 因此，本實驗采用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)致敗血癥休克和盲腸結扎和穿刺法(cecalligationandpuncture，CLP)致敗血癥休克的方法，研究mtNOS在敗血癥休克心功能抑制中所起的作用以及相關機制。 方法：1.大鼠敗血癥休克模型的復制(1)LPS模型：雄性SD大

4、鼠腹腔注射LPS1mg/g體重。另以生理鹽水組作為對照。 (2)CLP模型：雄性SD大鼠隨機分為手術組(CLP)和假手術組(SHAM)，4％水合氯醛1ml/100g體重麻醉，腹正中切口。CLP組結扎盲腸并用18號針頭穿孔兩次；SHAM組除不結扎穿孔盲腸外，其余操作均同CLP組。 2.大鼠血壓和心室動力學指標的測定大鼠以4％水合氯醛1ml/100g體重麻醉，行頸動脈插管，通過壓力傳感器連接MedLab系統(tǒng)記錄平均動脈血壓(

5、meanarterialbloodpressure，MABP)。行心室內導管術，測定心室動力學指標，包括心率(heartrate，HR)，左室發(fā)展壓(leftventriculardevelopedpressure，LVDP)，心室內壓最大上升/下降速率(maximalrise/fallvelocityofventricularpressure，±dP/dtmax)。監(jiān)測時先穩(wěn)定20min，然后觀測30min。 3.NOS的測定

6、處死大鼠，迅速取出心臟，用改良Krebs-Henseleit(K-H)液灌流除去血液，剪去心房及結締組織，取心室肌組織剪碎，加入冰冷的勻漿介質，制成10％勻漿，以1000×g在2℃離心10min，取上清液以8000×g在2℃離心10min，分別取上清液和沉淀，上清液即為所得胞漿液，沉淀再加入勻漿介質，混勻，以8000×g在2℃離心10min，取沉淀即為所得線粒體沉淀，加入混懸液使均勻混懸。所取胞漿液和線粒體混懸液按照試劑盒提供的方法測定

7、NOS的活性。蛋白含量采用考馬斯亮藍法測定。 4.亞硝基及硝基化合物(nitrite/nitrate，NOx-)取胞漿液，用Griess試劑染色并用分光光度計在530nm處測定NOx-濃度。 5.NO的測定采用NO熒光探針DAF-FMdiacetate檢測。線粒體用7μM的DAF-FMdiacetate在K+緩沖液4℃下孵育30min。洗脫兩次，在485m的激發(fā)波長，520nm的發(fā)散波長下測定吸光值。 6.Wes

8、ternblot檢測線粒體混懸液離心后取沉淀并用蛋白裂解液溶解，用BAC蛋白定量試劑盒定量。進行SDS-PAGE電泳，電印跡轉移法將凝膠內的蛋白質轉移至硝酸纖維素膜上，繼之用兔抗eNOS和二抗標記。顯色，壓片曝光，定影，進行密度分析。 7.線粒體滲透性轉換孔(mitochondrialpermeabilitytransitionpore，MPTP)功能的測定線粒體混懸液離心后取沉淀，用腫脹液使線粒體混懸。用分光光度計在520nm

9、波長下測定吸光值。 結果：第一部分LPS模型和CLP模型大鼠血流動力學及心肌細胞一氧化氮合酶活性改變的比較 1.血流動力學變化(1)血壓：CLP模型在早期有升高趨勢，但無明顯差異，中期和晚期均呈明顯下降趨勢(P＜0.01)。LPS模型呈明顯下降趨勢，但降幅明顯小于CLP模型晚期(P＜0.01)； (2)心室動力學：CLP模型早期LVDP與+dP/dtmax呈明顯增加，-dP/dtmax明顯降低。CLP模型中期±d

10、P/dtmax有顯著下降(P＜0.01)。CLP模型晚期和LPS模型各項指標均有明顯下降(P＜0.01)，在HR與LVDP兩項指標上，CLP模型晚期降低程度比LPS模型更為明顯(P＜0.01)。 (3)使用NOS阻斷劑L-NAME后，CLP晚期組與LPS組血壓均恢復至正常，兩組之間無明顯差異。CLP晚期組與LPS組心室動力學各項指標在使用L-NAME后均有所恢復，但與正常相比仍有明顯差異(P＜0.05)。 2.心肌細胞胞

11、漿NOS活性的變化CLP模型大鼠心肌細胞胞漿NOS活性在早期與Sham組無明顯差異，在中期達到最高，總NOS活性約為早期的5倍，cNOS增幅也約有3倍，而iNOS增幅達9倍；晚期組胞漿總NOS、iNOS和cNOS活性與Sham組相比也有明顯增加(P＜0.01)。LPS組總NOS、iNOS和cNOS活性較Sham組亦有明顯增加，其增幅與CLP晚期組相比無明顯差異。 3.心肌細胞mtNOS活性的變化CLP模型大鼠心肌細胞mtNOS活

12、性在中期明顯增高(P＜0.01)，晚期達到最高，增幅約為SHAM組的5倍。LPS模型mtNOS活性也有明顯增加，但是增幅遠不如CLP模型晚期，僅約CLP晚期組活性的58％。 4.L-NAME對敗血癥休克心肌細胞亞硝基及硝基化合物(nitrite/nitrate，NOx-)生成量的影響應用NOS抑制劑L-NAME后，CLP晚期組與LPS組NOx-生成量均明顯降低(P＜0.01)，CLP晚期與LPS組相比較，前者腹腔注射L-NAME

13、后總NOS與cNOS催化生成NO氧化生成NOX-的量均明顯低于后者，而iNOS催化生成NO氧化生成NOx-的量無明顯差異。 第二部分mtNOS在敗血癥休克心肌抑制中的作用 1.血流動力學變化(1)血壓：分別應用NOS非特異性阻斷劑L-NAME、iNOS阻斷劑AMG和nNOS阻斷劑7-NI后，大鼠血壓均有一定程度恢復，分別恢復至正常的86.2％、74.3％及79.2％。 (2)血流動力學：運用不同NOS阻斷劑后，敗

14、血癥休克大鼠心室動力學各指標，包括HR、LVDP、±dP/dtmax均有一定程度的恢復，其中使用AMG和7-NI僅在±dP/dtmax的恢復上有部分差異，AMG組+dP/dtmax的恢復好于7-NI，而7-NI則-dP/dtmax的恢復優(yōu)于AMG(P＜0.05)。 2.mtNOS蛋白印跡表達mtNOS在正常大鼠心肌細胞線粒體中幾乎不表達，而在CLP模型晚期表達明顯增強，增加約51.8％的表達，CLP手術后腹腔注射7-NI可明顯抑

15、制mtNOS的表達(P＜0.01)。 3.mtNOS與iNOS生成NO的比較SHAM組中，iNOS和mtNOS對NO的生成影響不大，但是在敗血癥休克晚期，iNOS和mtNOS生成的NO的量幾乎構成了細胞內NO的主要來源，二者生成的NO分別占細胞內總NO量的50.99％和37.04％，iNOS對于NO的生成較mtNOS可能起更大的作用，單獨測定iNOS在胞漿中生成NO的比例，其生成占胞漿總NO量86.62％的比例也暗示敗血癥休克晚

16、期NO的生成可能主要是iNOS的過量表達。 第三部分mtNOS和MPTP之間的關系 1.NOS抑制劑對于敗血癥休克心肌細胞線粒體MPTP的影響正常的SHAM組在加入200μMCaCl2后吸光值明顯下降，而CLP晚期組和溶媒組吸光度未明顯降低。在使用L-NAME或者7-NI后，可見吸光度較CLP晚期組或溶媒組明顯降低(P＜0.01)，而使用AMG未見吸光度的明顯改變。 2.CsA和Atr對于敗血癥休克心肌細胞線粒體

17、MPTP的影響在加入200μMCaCl2后，各組均未能見到吸光度的明顯改變。 3.mtNOS在敗血癥休克晚期給予CsA以及Atr的蛋白印跡分析敗血癥休克模型加入Atr后，mtNOS的表達較CLP晚期進一步增強(P＜0.01)，但是Atr不能影響7-NI的作用；而加入CsA后，mtNOS的表達幾乎被完全抑制(P＜0.01)。 結論：1.在LPS模型中，iNOS可能是導致敗血癥休克NO過量生成的唯一原因；而在CLP模型中，c