血清3型鴨甲型肝炎病毒HuB60株安全性及遺傳穩(wěn)定性研究.pdf

1、血清3型鴨甲型肝炎病毒(DHAV-3)是近年來(lái)成為引起我國(guó)雛鴨肝炎的主要病原之一，因此，研發(fā)安全有效的血清3型鴨甲型肝炎疫苗是當(dāng)務(wù)之急。目前，本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)成功將一株DHAV-3 HuB分離株通過(guò)SPF雞胚連續(xù)傳代培養(yǎng)60代次，獲得了DHAV-3減毒株HuB60。本研究通過(guò)將HuB60株連續(xù)回歸SPF雛鴨進(jìn)行毒力返強(qiáng)試驗(yàn)，從臨床和剖檢觀察、病理組織學(xué)和肝功能指標(biāo)檢查及病毒全基因測(cè)序分析等方面進(jìn)行研究，以了解HuB60株的安全性和遺傳穩(wěn)定性

2、，為篩選理想的疫苗候選毒株提供理論依據(jù)。主要研究?jī)?nèi)容包括：
　　1. HuB60毒株毒力返強(qiáng)試驗(yàn)的臨床及剖檢觀察
　　臨床觀察毒力返強(qiáng)試驗(yàn)的各傳代試驗(yàn)鴨，各代次回歸試驗(yàn)鴨的精神、飲水、采食、生長(zhǎng)情況均正常；隨機(jī)撲殺的試驗(yàn)鴨進(jìn)行解剖觀察，肝、脾、腎、胰、肺、腦、腸道等組織器官無(wú)肉眼可見(jiàn)病理變化。強(qiáng)毒對(duì)照鴨，于感染DHAV-3 SD強(qiáng)毒后24h左右開(kāi)始出現(xiàn)了神經(jīng)癥狀，運(yùn)動(dòng)失調(diào)、頭往后背，兩腿后蹬，呈現(xiàn)明顯的角弓反張的姿勢(shì)，并很快

3、死亡；剖檢觀察見(jiàn)肝臟腫大、呈點(diǎn)狀或斑塊狀出血、質(zhì)脆，脾臟、腎臟腫大等變化,表明HuB60毒株安全、毒力穩(wěn)定。
　　2. HuB60毒力返強(qiáng)試驗(yàn)雛鴨肝組織病毒檢測(cè)
　　通過(guò)對(duì)毒力返強(qiáng)試驗(yàn)各回歸代次鴨肝組織 RT-PCR檢測(cè)均能檢測(cè)到 DHAV-3陽(yáng)性，采用接種雞胚的方法能成功地從各回歸代次試驗(yàn)鴨肝組織分離到DHAV-3，并且從肝組織毒價(jià)測(cè)定結(jié)果可知第1、2代回歸試驗(yàn)鴨的肝組織含毒量相對(duì)較低，為10-4.70-10-4.92EL

4、D50/ml，回歸第3代以后鴨的肝組織毒含量穩(wěn)定在-7.02-10-8.08ELD50/ml范圍內(nèi)，表明HuB60毒株能在鴨體穩(wěn)定增殖。
　　3. HuB60毒株對(duì)雛鴨肝功能影響的研究
　　通過(guò)對(duì)毒力返強(qiáng)試驗(yàn)的各代次回歸試驗(yàn)鴨接種病毒后48h采血、分離血清，進(jìn)行谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶(GGT)、堿性磷酸酶(ALP)四種血清酶和膽紅素指標(biāo)的測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果顯示：試驗(yàn)鴨的四種反映肝功能指標(biāo)血清酶

5、和總膽紅素(TBIL)測(cè)定值與健康對(duì)照鴨均無(wú)明顯差異，但強(qiáng)毒對(duì)照鴨的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和堿性磷酸酶(ALP)顯著升高。試驗(yàn)結(jié)果表明HuB60株對(duì)雛鴨肝臟細(xì)胞無(wú)損傷。
　　4. HuB60毒株對(duì)雛鴨組織器官的損傷研究
　　通過(guò)對(duì)毒力返強(qiáng)試驗(yàn)的第5、第8代試驗(yàn)鴨主要內(nèi)臟組織進(jìn)行組織病理切片檢查，均未發(fā)現(xiàn)組織結(jié)構(gòu)有異常變化。試驗(yàn)雛鴨肝臟組織肝鎖、肝小葉結(jié)構(gòu)清晰；肺泡內(nèi)無(wú)異物；腎小球結(jié)構(gòu)清晰、無(wú)腫脹等異常。S

6、D強(qiáng)毒對(duì)照鴨肝臟出血、肝細(xì)胞腫脹壞死，并伴有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；脾臟的脾小結(jié)內(nèi)淋巴細(xì)胞稀疏，生發(fā)中心不明顯或消失，出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞；腎臟腎小球腫脹、腎小囊腔消失；心臟肌纖維斷裂、心肌出血等。從組織病理學(xué)方面證明HuB60株毒力不易返強(qiáng)。
　　5. HuB60毒株在遺傳穩(wěn)定性的研究
　　HuB60毒株不包括Poly（A）尾的核苷酸序列全長(zhǎng)為7773個(gè)核苷酸殘基，包括長(zhǎng)度為651nt的5’UTR、366nt的3’UTR和由6756個(gè)核

7、苷酸組成的ORF，其中ORF可編碼2252個(gè)氨基酸的多聚蛋白。通過(guò)對(duì)HuB60-F5與HuB60全序列比對(duì)和分析結(jié)果表明，全基因組核苷酸序列沒(méi)有發(fā)生插入或缺失，兩者僅有6個(gè)核苷酸差異，但ORF氨基酸序列未發(fā)生改變，說(shuō)明6個(gè)位點(diǎn)發(fā)生的核酸序列突變僅為沉默突變，對(duì)病毒的毒力和致病性不會(huì)產(chǎn)生影響。但是HuB60-F8與HuB60相比，F(xiàn)8的ORF中2個(gè)堿基的突變引起了氨基酸發(fā)生變化，這兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)均位于2C蛋白，即1242位點(diǎn)的脯氨酸(P)