鴨甲型肝炎病毒VP0、VP1截短基因的表達(dá)及初步應(yīng)用.pdf

1、鴨病毒性肝炎(Duck Viral Hepatitis，DVH)是由小RNA病毒DHV(Duck Hepatitis Virus)引起的一種以雛鴨肝炎和出血為主要病變的傳染性極強(qiáng)的疾病。VP0、VP1作為DHV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，有很好的免疫原性。通過對VP0、VP1基因截短，篩選出親水性強(qiáng)的優(yōu)勢抗原區(qū)并進(jìn)行表達(dá)，制備了VP0、VP1截短基因的多克隆抗體(PcAb)，建立了檢測鴨甲型病毒性肝炎抗原抗體的快速檢測方法。
　　1.VP0、

2、VP1截短基因的表達(dá)
　　以VP0、VP1基因?yàn)槟０澹?jīng)PCR擴(kuò)增得到VP0F1、VP0F2、VP0F3、VP1F1、VP1F2共5段序列，將VP0F1-3、VP1F1-2各自拼接得到VP0、VP1截短基因。將VP0、VP1截短基因克隆到表達(dá)載體pET28a，構(gòu)建pET28a-VP0/VP1（截短）重組質(zhì)粒，在16℃過夜條件下經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得VP0、VP1截短蛋白并進(jìn)行純化。結(jié)果經(jīng)SDS-PAGE及westernblot分析，證

3、明VP0、VP1截短蛋白純化效果良好，免疫原性強(qiáng)。
　　2.鴨甲型病毒性肝炎抗體間接ELISA檢測方法的建立
　　以純化的VP0截短蛋白為包被抗原，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗鴨IgY為酶標(biāo)二抗，建立了檢測鴨甲型病毒性肝炎抗體的間接ELISA方法。通過優(yōu)化各種條件，最終確定VP0截短蛋白最佳包被濃度為2μg/mL，鴨血清最佳稀釋度為1∶320，HRP標(biāo)記的兔抗鴨IgY最佳稀釋度為1∶4000，該方法特異性強(qiáng)、敏感性高、

4、重復(fù)性好。
　　3.VP0、VP1截短蛋白多克隆抗體的制備
　　以純化的鴨甲型肝炎病毒VP0、VP1截短基因的重組蛋白為免疫原，四次免疫體重約2.5kg的白兔。效價較高時頸動脈采血，收集并純化血清，制備抗VP0、VP1截短蛋白多克隆抗體。以純化的DHAV為包被抗原，用間接ELISA檢測VP0、VP1截短蛋白多抗的效價，結(jié)果顯示抗VP0截短蛋白多抗的效價為51200，抗VP1截短蛋白多抗的效價為12800。
　　4.鴨甲

5、型病毒性肝炎抗原夾心ELISA檢測方法的建立
　　以純化的VP0截短蛋白多抗為包被抗體，以鴨多抗為檢測抗體，建立了檢測鴨甲型病毒性肝炎抗原的夾心ELISA方法。通過對各級條件的優(yōu)化，確定VP0截短蛋白多抗最佳包被稀釋度為1∶16000，鴨多抗最佳稀釋度為1∶200，HRP標(biāo)記的兔抗鴨IgY最佳稀釋度為1∶3000。由試驗(yàn)結(jié)果可知該方法重復(fù)性好、特異性強(qiáng)。
　　綜上可知，本研究通過篩選VP0、VP1基因的親水強(qiáng)的優(yōu)勢抗原區(qū)，成