用熒光標記的大腸桿菌構(gòu)建細菌性前列腺炎模型及其量化評價.pdf

1、[目的]
　　 1.利用綠色熒光蛋白標記的大腸桿菌進行體外抑菌試驗，通過測定熒光強度和熒光拍照，比較幾種抗菌藥的抑菌效果。
　　 2.采用綠色熒光蛋白標記的大腸桿菌構(gòu)建細菌性前列腺炎模型，觀察細菌在組織中的侵襲路徑和機體免疫系統(tǒng)中的吞噬細胞對細菌侵襲的作用。
　　 3.建立致病菌和抗菌藥的可視化分析方法，探索更精確的抗菌藥治療細菌性前列腺炎在體藥動學(xué)-藥效學(xué)(PK/PD)混合動力學(xué)模型的研究方法。
　　

2、[方法]
　　 1.熒光標記的大腸桿菌體外抗生素抑菌試驗的研究1.1.GFP基因PCR檢測按照文獻記錄的條件對K88：gfp/lux進行PCR檢測。
　　 1.2.抗生素的體外抑菌試驗利用含有綠色熒光蛋白(GFP)基因致病菌進行幾種藥物的體外抑菌試驗，根據(jù)NCCLS推薦的試管二倍稀釋法、微量稀釋法和瓊脂稀釋法進行抗菌藥的體外抑菌試驗，通過熒光強度測定和熒光拍照對三種方法的結(jié)果進行比較。
　　 2.用GFP標記的大

3、腸桿菌K88建立大鼠細菌性前列腺炎動物模型和抗菌藥體內(nèi)抑菌試驗的研究2.1.大腸桿菌所致大鼠細菌性前列腺炎模型的制備用含有綠色熒光蛋白(GFP)基因致病菌建立細菌性前列腺炎模型；根據(jù)病理切片，熒光、普通光對比照片以及組織熒光強度測定，推測細菌侵襲路徑和機體免疫系統(tǒng)的反應(yīng)。
　　 2.2.抗生素體內(nèi)抑菌試驗的研究按2.1中方法建立細菌性前列腺炎模型，前列腺炎模型鼠腹腔注射不同劑量的鹽酸左氧氟沙星，每12小時給藥一次，給藥3天，第四

4、天給藥1h后心臟取血和前列腺組織，組織處理后熒光拍照已經(jīng)測熒光強度，同時采用高效液相色譜法測定測定藥物在血液和組織中的濃度，通過熒光強度比和血藥濃度的關(guān)系進行致病菌和抗菌藥的原位定量化分析。
　　 [結(jié)果]
　　 1.熒光標記的大腸桿菌體外抗菌藥抑菌試驗的研究1.1.GFP基因PCR檢測按照文獻記錄的條件對K88：gfp/lux進行PCR檢測，得出K88：gfp/lux菌株含有g(shù)fp基因。
　　 1.2.抗生素的

5、體外抑菌試驗阿奇霉素、慶大霉素、環(huán)丙沙星、鹽酸左氧氟沙星對K88：gfp/lux的MIC分別為16μg/mL、1μg/mL、1μg/mL、1μg/mL，MBC分為32μg/mL、1μg/mL、1μg/mL、1μg/mL。
　　 2.用GFP標記的大腸桿菌K88建立大鼠細菌性前列腺炎動物模型和抗菌藥體內(nèi)抑菌試驗的研究2.1.大腸桿菌所致大鼠細菌性前列腺炎模型的制備通過表面拍照和切片可以看出在造模1d大鼠前列腺左右兩側(cè)葉已發(fā)生病理變

6、化，細菌已經(jīng)侵襲腺腔且在其中大量繁殖；造模2d時，在熒光圖中可以看出吞噬細胞由于吞噬攜帶綠色熒光的大腸桿菌而使得自身有熒光；造模3d腺體含大量炎癥細胞，炎癥細胞開始進入腺腔內(nèi)，吞噬細胞的進入使得腺腔內(nèi)有大量晶簇狀熒光產(chǎn)生；造模4d腺體結(jié)構(gòu)變形，內(nèi)可見脫落壞死的腺細胞，增生的纖維細胞向腺體內(nèi)延伸，增生較嚴重；造模5d，大量炎癥細胞增生滲出，腺腔上皮細胞明顯壓扁，少數(shù)被破壞，腺腔形成膿腫；造模6d，腺體原有結(jié)構(gòu)已被破壞，腺體細胞變質(zhì)，上皮細

7、胞被破壞，僅剩腺腔的輪廓。腺腔內(nèi)和間質(zhì)彌漫著大量炎癥細胞。
　　 2.2.抗菌藥體內(nèi)抑菌試驗的研究2.2.1.血液和組織中鹽酸左氧氟沙星分析方法學(xué)考察模型大鼠血液中，低、中、高濃度組的方法平均回收率分別為80.5％、83.2％、89.7％；日內(nèi)精密度分別為7.56％、6.47％、4.73％；日間精密度分別為8.90％、6.63％、5.81％。模型大鼠組織勻漿液中，低、中、高濃度組的方法平均回收率分別為85.41％、89.0％、8

8、7.3％；日內(nèi)精密度分別為5.98％、6.36％、4.32％；日間精密度分別為7.15％、7.32％、3.77％。說明該方法靈敏，重現(xiàn)性好。
　　 2.2.2.PK/PD模型建立利用模型組熒光強度與治療組熒光強度差值與模型組熒光強度比，得出的結(jié)果與組織中藥物濃度做圖，初步得出在體PD/PK模型。
　　 [結(jié)論]
　　 1.本研究首次利用綠色熒光蛋白標記的細菌進行藥物體外抑菌試驗，得出幾種抗菌藥體外不同濃度的抑菌情

9、況，同時得出細菌在不同濃度的抗菌藥的抑菌作用下的生長曲線，該方法不僅可以更簡便、快速的得出MIC和MBC，而且可以更準確、詳細的發(fā)現(xiàn)藥物對細菌以及細菌對藥物二者之前的影響，對研究新藥的藥理作用機制有較大幫助。
　　 2.本研究首次利用綠色熒光蛋白標記的細菌構(gòu)建細菌性前列腺炎模型，利用表面拍照和病理切片相對比得出細菌在前列腺組織中的侵襲路徑以及機體免疫系統(tǒng)中的吞噬細胞對細菌侵襲的作用。
　　 3.本研究利用測定治療后組織的