用熒光標(biāo)記的大腸桿菌構(gòu)建細(xì)菌性前列腺炎模型及其量化評(píng)價(jià).pdf

1、[目的]
　　 1.利用綠色熒光蛋白標(biāo)記的大腸桿菌進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，通過測(cè)定熒光強(qiáng)度和熒光拍照，比較幾種抗菌藥的抑菌效果。
　　 2.采用綠色熒光蛋白標(biāo)記的大腸桿菌構(gòu)建細(xì)菌性前列腺炎模型，觀察細(xì)菌在組織中的侵襲路徑和機(jī)體免疫系統(tǒng)中的吞噬細(xì)胞對(duì)細(xì)菌侵襲的作用。
　　 3.建立致病菌和抗菌藥的可視化分析方法，探索更精確的抗菌藥治療細(xì)菌性前列腺炎在體藥動(dòng)學(xué)-藥效學(xué)(PK/PD)混合動(dòng)力學(xué)模型的研究方法。
　　

2、[方法]
　　 1.熒光標(biāo)記的大腸桿菌體外抗生素抑菌試驗(yàn)的研究1.1.GFP基因PCR檢測(cè)按照文獻(xiàn)記錄的條件對(duì)K88：gfp/lux進(jìn)行PCR檢測(cè)。
　　 1.2.抗生素的體外抑菌試驗(yàn)利用含有綠色熒光蛋白(GFP)基因致病菌進(jìn)行幾種藥物的體外抑菌試驗(yàn)，根據(jù)NCCLS推薦的試管二倍稀釋法、微量稀釋法和瓊脂稀釋法進(jìn)行抗菌藥的體外抑菌試驗(yàn)，通過熒光強(qiáng)度測(cè)定和熒光拍照對(duì)三種方法的結(jié)果進(jìn)行比較。
　　 2.用GFP標(biāo)記的大

3、腸桿菌K88建立大鼠細(xì)菌性前列腺炎動(dòng)物模型和抗菌藥體內(nèi)抑菌試驗(yàn)的研究2.1.大腸桿菌所致大鼠細(xì)菌性前列腺炎模型的制備用含有綠色熒光蛋白(GFP)基因致病菌建立細(xì)菌性前列腺炎模型；根據(jù)病理切片，熒光、普通光對(duì)比照片以及組織熒光強(qiáng)度測(cè)定，推測(cè)細(xì)菌侵襲路徑和機(jī)體免疫系統(tǒng)的反應(yīng)。
　　 2.2.抗生素體內(nèi)抑菌試驗(yàn)的研究按2.1中方法建立細(xì)菌性前列腺炎模型，前列腺炎模型鼠腹腔注射不同劑量的鹽酸左氧氟沙星，每12小時(shí)給藥一次，給藥3天，第四

4、天給藥1h后心臟取血和前列腺組織，組織處理后熒光拍照已經(jīng)測(cè)熒光強(qiáng)度，同時(shí)采用高效液相色譜法測(cè)定測(cè)定藥物在血液和組織中的濃度，通過熒光強(qiáng)度比和血藥濃度的關(guān)系進(jìn)行致病菌和抗菌藥的原位定量化分析。
　　 [結(jié)果]
　　 1.熒光標(biāo)記的大腸桿菌體外抗菌藥抑菌試驗(yàn)的研究1.1.GFP基因PCR檢測(cè)按照文獻(xiàn)記錄的條件對(duì)K88：gfp/lux進(jìn)行PCR檢測(cè)，得出K88：gfp/lux菌株含有g(shù)fp基因。
　　 1.2.抗生素的

5、體外抑菌試驗(yàn)阿奇霉素、慶大霉素、環(huán)丙沙星、鹽酸左氧氟沙星對(duì)K88：gfp/lux的MIC分別為16μg/mL、1μg/mL、1μg/mL、1μg/mL，MBC分為32μg/mL、1μg/mL、1μg/mL、1μg/mL。
　　 2.用GFP標(biāo)記的大腸桿菌K88建立大鼠細(xì)菌性前列腺炎動(dòng)物模型和抗菌藥體內(nèi)抑菌試驗(yàn)的研究2.1.大腸桿菌所致大鼠細(xì)菌性前列腺炎模型的制備通過表面拍照和切片可以看出在造模1d大鼠前列腺左右兩側(cè)葉已發(fā)生病理變

6、化，細(xì)菌已經(jīng)侵襲腺腔且在其中大量繁殖；造模2d時(shí)，在熒光圖中可以看出吞噬細(xì)胞由于吞噬攜帶綠色熒光的大腸桿菌而使得自身有熒光；造模3d腺體含大量炎癥細(xì)胞，炎癥細(xì)胞開始進(jìn)入腺腔內(nèi)，吞噬細(xì)胞的進(jìn)入使得腺腔內(nèi)有大量晶簇狀熒光產(chǎn)生；造模4d腺體結(jié)構(gòu)變形，內(nèi)可見脫落壞死的腺細(xì)胞，增生的纖維細(xì)胞向腺體內(nèi)延伸，增生較嚴(yán)重；造模5d，大量炎癥細(xì)胞增生滲出，腺腔上皮細(xì)胞明顯壓扁，少數(shù)被破壞，腺腔形成膿腫；造模6d，腺體原有結(jié)構(gòu)已被破壞，腺體細(xì)胞變質(zhì)，上皮細(xì)

7、胞被破壞，僅剩腺腔的輪廓。腺腔內(nèi)和間質(zhì)彌漫著大量炎癥細(xì)胞。
　　 2.2.抗菌藥體內(nèi)抑菌試驗(yàn)的研究2.2.1.血液和組織中鹽酸左氧氟沙星分析方法學(xué)考察模型大鼠血液中，低、中、高濃度組的方法平均回收率分別為80.5％、83.2％、89.7％；日內(nèi)精密度分別為7.56％、6.47％、4.73％；日間精密度分別為8.90％、6.63％、5.81％。模型大鼠組織勻漿液中，低、中、高濃度組的方法平均回收率分別為85.41％、89.0％、8

8、7.3％；日內(nèi)精密度分別為5.98％、6.36％、4.32％；日間精密度分別為7.15％、7.32％、3.77％。說明該方法靈敏，重現(xiàn)性好。
　　 2.2.2.PK/PD模型建立利用模型組熒光強(qiáng)度與治療組熒光強(qiáng)度差值與模型組熒光強(qiáng)度比，得出的結(jié)果與組織中藥物濃度做圖，初步得出在體PD/PK模型。
　　 [結(jié)論]
　　 1.本研究首次利用綠色熒光蛋白標(biāo)記的細(xì)菌進(jìn)行藥物體外抑菌試驗(yàn)，得出幾種抗菌藥體外不同濃度的抑菌情

9、況，同時(shí)得出細(xì)菌在不同濃度的抗菌藥的抑菌作用下的生長曲線，該方法不僅可以更簡便、快速的得出MIC和MBC，而且可以更準(zhǔn)確、詳細(xì)的發(fā)現(xiàn)藥物對(duì)細(xì)菌以及細(xì)菌對(duì)藥物二者之前的影響，對(duì)研究新藥的藥理作用機(jī)制有較大幫助。
　　 2.本研究首次利用綠色熒光蛋白標(biāo)記的細(xì)菌構(gòu)建細(xì)菌性前列腺炎模型，利用表面拍照和病理切片相對(duì)比得出細(xì)菌在前列腺組織中的侵襲路徑以及機(jī)體免疫系統(tǒng)中的吞噬細(xì)胞對(duì)細(xì)菌侵襲的作用。
　　 3.本研究利用測(cè)定治療后組織的