Cd40分子突變體在人卵巢癌中的表達及其臨床意義.pdf

1、CD40分子是一個重要的協(xié)同刺激分子，可以通過增強抗原遞呈細胞(APC)的抗原遞呈能力來參與免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)。由于CD40分子廣泛表達在B細胞、血管內(nèi)皮細胞等正常組織細胞表面，同時還異常表達在一系列腫瘤和白血病細胞，以CD40為靶點的腫瘤抗體治療越發(fā)得到人們的重視。在本實驗室以往的研究中，發(fā)現(xiàn)特異性表達在一些腫瘤細胞株和新鮮腫瘤細胞上的CD40突變體分子(muCD40)(CAC→CAA，78His→78Gln)，該突變位點位于CD40胞外段

2、的第二個富含半胱氨酸的區(qū)域，這一區(qū)域是CD40與CD40L(CD154)相互作用的重要區(qū)域，該突變使muCD40分子與CD40L的親和力明顯下降。在種系的進化過程中，78位組氨酸高度保守，提示其對維持CD40的正常結(jié)構(gòu)和功能具有非常重要的作用。該突變體僅表達于腫瘤上而不表達于正常組織中，提示muCD40分子可能可以作為一個腫瘤免疫治療的新靶點。而且該突變體是否改變了CD40正常信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，是否會異于wtCD40分子介導(dǎo)截然不同的生物學(xué)功

3、能，還有待進一步研究。
　　 目的:檢測muCD40分子在卵巢癌細胞株中的表達;分析muCD40信號激發(fā)后對卵巢癌細胞的增殖，遷移及侵襲的影響并初步探討其信號通路機制。同時檢測人卵巢癌組織中muCD40的表達，觀察其與卵巢癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系，探討其在卵巢癌中表達的意義。
　　 方法:以表達muCD40的HO8910和同時表達wtCD40/muCD40的SKOV3卵巢癌細胞株為研究對象，以抗wtCD40單克隆抗體5C11

4、及抗muCD40單克隆抗體5H6作為研究工具，流式細胞儀檢測wtCD40/muCD40分子在卵巢癌細胞上的表達;細胞計數(shù)方法-8(cellcountingkit-8，CCK-8)檢測5H6或5C11刺激后對卵巢癌細胞增殖的影響;流式細胞術(shù)分析5H6作用后HO8910細胞的細胞周期的變化;共聚焦顯微鏡檢測wtCD40/muCD40在SKOV3上的表達;Westernblotting檢測5H6作用后HO8910細胞中相關(guān)信號通路PI3K-A

5、KT蛋白的磷酸化;劃痕實驗與Transwell實驗檢測wtCD40/muCD40信號在卵巢癌細胞遷移、侵襲過程中發(fā)揮的作用。收集卵巢癌手術(shù)切除組織54例，統(tǒng)計患者病理資料;通過免疫組織化學(xué)染色方法，分析muCD40分子在卵巢癌組織中的表達，統(tǒng)計學(xué)分析其表達與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。
　　 結(jié)果:單抗5H6能夠以濃度依賴性促進表達muCD40的HO8910細胞的增殖，且濃度為10μg/mL時5H6促增值作用最為明顯(P＜0.05);

6、單抗5H6及5C11對共表達wtCD40/muCD40的SKOV3細胞的增殖能力沒有明顯作用;單抗5H6可以使HO8910細胞的G1/G0期細胞減少，S期細胞增多(P＜0.05)，以10μg/mL的5H6作用最為明顯;然而共聚焦顯微鏡檢測發(fā)現(xiàn)5H6或5C11刺激后，wtCD40/muCD40分子在SKOV3細胞表面發(fā)生聚集現(xiàn)象，提示wtCD40/muCD40分子可能以異源三聚體的形式參與CD40信號傳導(dǎo);5H6作用后，HO8910細胞的

7、p-AKT蛋白的表達上調(diào)，在20min時尤為明顯;單抗5C11激發(fā)后可使SKOV3細胞的遷移能力增強，與對照組相比，10μg/mL.5C11激發(fā)后劃痕愈合作用明顯(P＜0.05)，而單抗5H6作用后HO8910與SKOV3細胞的遷移能力無明顯改變。同樣的，單抗5H6對兩個卵巢癌細胞株的侵襲能力均無作用，而單抗5C11可使SKOV3的侵襲能力增強(P＜0.05);免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，54例卵巢癌患者中，28例患者組織低表達或不表達muC

8、D40分子，占51.9％;26例患者組織高表達muCD40分子，占48.1％。muCD40在卵巢癌組織上的表達水平與患者年齡、腫瘤大小、腫瘤分期以及腫瘤類型無顯著相關(guān)性，但與腫瘤分化程度密切相關(guān)。
　　 結(jié)論:抗muCD40單抗5H6可能通過PI3-AKT途徑促進高表達muCD40的卵巢癌細胞株HO8910的增殖;而單抗5H6/5C11不能促進wtCD40/muCD40共表達的SKOV3細胞增殖，同時發(fā)現(xiàn)wtCD40/muCD4