石油污染對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)影響及菲降解菌的篩選鑒定.pdf

1、天然石油是由各種碳?xì)浠衔锝M成的復(fù)雜混合物，在開采、運(yùn)輸、加工等過程中釋放到環(huán)境中的烴類化合物正是土壤污染的主要原因之一，石油污染物在環(huán)境中長(zhǎng)期積累且難被消除，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)及人類健康造成嚴(yán)重危害。石油污染物對(duì)土壤中的一些微生物具有毒害抑制作用，而有些微生物能降解轉(zhuǎn)化石油烴并為自身提供碳源和能源，所以石油污染物會(huì)改變土壤微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)，土壤石油污染與微生物群落的多樣性和群落結(jié)構(gòu)的關(guān)系值得深入研究。
　　本研究中，第一部分內(nèi)容旨

2、在找出油污土中微生物菌群結(jié)構(gòu)的特征，揭示石油污染對(duì)土壤微生物多樣性的影響，采用二代高通量測(cè)序平臺(tái)，對(duì)準(zhǔn)東油田不同污染程度的油污土和背景土中的細(xì)菌（16S rRNA序列）和真菌（ITS序列）特征序列進(jìn)行測(cè)定和比對(duì)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析。第二部分內(nèi)容為了進(jìn)一步分離純化準(zhǔn)東油污土中的菲降解菌，以芳香烴菲為唯一碳源，連續(xù)五次進(jìn)行液體富集培養(yǎng)后，離心收集菌體，提取菲降解菌基因組DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用二代高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)菲降解菌的16S

3、 rRNA進(jìn)行測(cè)序和比對(duì)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析。研究結(jié)果如下：
　　1、利用 miseq平臺(tái)對(duì)不同油污土樣和背景土樣的土壤微生物進(jìn)行測(cè)序，并對(duì)序列進(jìn)行修剪優(yōu)化后，共得到97036個(gè)真菌ITS序列、93033個(gè)細(xì)菌16S rRNA序列；利用Usearch軟件對(duì)優(yōu)化序列進(jìn)行OTU分類及同源比對(duì)，得到了5門、18綱、45目、76科、126屬、180種共15349個(gè)真菌，其中優(yōu)勢(shì)菌群為子囊菌門（Ascomycota）和擔(dān)子菌門（Ba

4、sidiomycota）；得到16門、31綱、72目、134科、230屬、310種共13346個(gè)細(xì)菌，其中的優(yōu)勢(shì)菌群為放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）及變形菌（Proteobacteria），其中厚壁菌門在石油污染樣本中含量劇減，說(shuō)明石油污染物對(duì)厚壁菌門有一定的抑制毒害作用，而放線菌門和變形菌門在石油污染樣本中含量劇增，可能是因?yàn)檫@兩種菌能降解石油烴。
　　2、通過對(duì)各樣本的多樣性指數(shù)分析

5、可知，樣本中的真菌Chao/ Ace豐度指數(shù)依次為2B>3A>1B>1A>2B>3B，Simpson/shannon指數(shù)顯示樣本3B的多樣性最高，總體而言真菌菌群結(jié)構(gòu)受石油污染的影響較小。樣本中的細(xì)菌Chao/Ace豐度指數(shù)依次為2A>1A>3A>2B>1B>3B，Simpson/shannon指數(shù)顯示多樣性最高的是樣本3A，其次是1A，整體上看，一定濃度的石油污染能提高土壤細(xì)菌豐度和多樣性。
　　3、使用Qiime軟件對(duì)樣本微生

6、物進(jìn)行聚類分析，對(duì)于真菌菌群而言，1A為一類，剩下的五個(gè)樣本為一類，距離最近的是樣本是2A和2B，距離最遠(yuǎn)的是樣本1A和樣本2A/2B，距離均為0.18；對(duì)于細(xì)菌菌群而言，1A為一類，剩下的五個(gè)樣本為一類，樣本1B/3B及樣本2A、3A之間的距離最近，距離最遠(yuǎn)的是樣本1A和樣本1B/3B，距離均為0.23。這說(shuō)明石油污染物及污染程度都在一定程度上影響土壤微生物的遺傳進(jìn)度及結(jié)構(gòu)，細(xì)菌菌群受到的影響更為明顯。主成分分析結(jié)果表示各樣本間差異度

7、主要由石油污染物造成，污染年限為5年的樣本1A與污染年限只有1年和3年的2A、3A之間存在較大差異。這說(shuō)明長(zhǎng)達(dá)五年的生物降解使得1A土樣中的污染物成分發(fā)生較大改變，使樣本1A的特異性更加明顯。同時(shí)，不同污染年限的樣本土壤之間也存在較大差異，這表明不同的污染物成分和不同污染物濃度都在很大程度上影響了環(huán)境中的群落結(jié)構(gòu)和特征。
　　4、菲降解菌液體富集培養(yǎng)后，經(jīng)過測(cè)序分析共得到33個(gè)OTU序列，共得到4門、8綱、14目、13科、26屬共

8、27種細(xì)菌菌株，總共43630個(gè)reads。其中變形菌門占95％，為最優(yōu)勢(shì)菌群。α-變形菌菌綱（Alphaproteobacteria）下的鞘脂單胞菌（Sphingomonadaceae）數(shù)量最多，比例在85%以上，其次是β-變形菌綱（Betaproteobacteria）下的草酸桿菌（Oxalobacteraceae），占整體的14%。這表明這兩種菌能高效降解并利用菲完成自身的生長(zhǎng)繁殖。
　　5、通過 PCA分析，對(duì)樣本中菲降解