大慶油田石油污染土壤堆肥修復(fù)及微生物群落結(jié)構(gòu)研究.pdf

1、堆肥是修復(fù)石油污染土壤的重要技術(shù)之一。微生物在堆肥過程中對石油的降解起著關(guān)鍵作用，然而，鑒于土壤微生物的復(fù)雜性和不同生態(tài)條件下土壤微生物群落的差異性，目前對于石油污染土壤堆肥（尤其是強(qiáng)化堆肥）中的微生物群落結(jié)構(gòu)以及強(qiáng)化降解機(jī)制的研究還十分有限。本研究從大慶石油污染土壤中分離篩選高效石油烴降解菌群和鼠李糖脂表面活性劑產(chǎn)生菌，在此基礎(chǔ)上研究不同堆肥方式（自然堆肥、表面活性劑強(qiáng)化堆肥和復(fù)合菌群強(qiáng)化堆肥）對大慶石油污染土壤中石油的降解情況，采用

2、16s rDNA高通量測序技術(shù)檢測堆肥過程中微生物群落結(jié)構(gòu)，分析石油烴降解過程與微生物群落之間的關(guān)系;構(gòu)建AlkB（烷烴單加氧酶）功能基因克隆文庫，分析堆肥各時(shí)期烴降解功能微生物的多樣性和結(jié)構(gòu)變化;對AlkB基因進(jìn)行熒光定量PCR檢測，研究烴降解功能菌群的數(shù)量、活性特征與石油烴降解過程之間的關(guān)系，研究揭示了堆肥過程中石油降解的微生物生態(tài)學(xué)機(jī)制，為大慶油田及其他油田石油污染土壤的堆肥修復(fù)提供理論依據(jù)。論文的主要研究結(jié)果如下:
　　(

3、1)從大慶油田石油污染土壤與牛糞、秸稈的堆肥體系中分離篩選到耐高溫石油降解菌群wt-3，通過16S rDNA鑒定，該菌群優(yōu)勢屬為芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、紅球菌屬、假黃單胞菌屬和賴氨芽孢桿菌屬。wt-3降解石油的最佳條件是:培養(yǎng)溫度45℃、初始pH為7.0、接種量3％、搖床轉(zhuǎn)數(shù)160r/min、培養(yǎng)基石油濃度2％，此條件下最高降解率為75.3％。柱層析分析表明，wt-3對原油組分中飽和烴、芳香烴、瀝青質(zhì)和膠質(zhì)的降解率分別為83％、50％、

4、25％和30％，說明該復(fù)合菌群能夠有效的降解石油污染物。
　　(2)從大慶石油污染土壤中篩選篩選到一株高產(chǎn)表面活性劑的菌株wk-4，經(jīng)生理生化及16S rDNA鑒定確定該菌株為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。該菌株的產(chǎn)表面活性劑的最優(yōu)發(fā)酵條件為:碳源豆油10 g/L、氮源氯化銨5g/L、發(fā)酵時(shí)間120 h時(shí)，此條件下糖脂類表面活性劑的產(chǎn)量可達(dá)0.81 g/L，在已有報(bào)道文獻(xiàn)中產(chǎn)量較高。經(jīng)薄層層析法確定

5、該表面活性劑為糖脂類表面活性劑，硅膠柱純化后收集得到單雙鼠李糖脂兩種組分。該鼠李糖脂產(chǎn)物臨界膠束濃度為50mg/L，鹽濃度耐受范圍為0％-6％，pH耐受范圍為3.0-12.0，適宜溫度范圍為20℃-100℃，可應(yīng)用于堆肥處理中。在石油污染土壤的原位修復(fù)試驗(yàn)中，添加3CMC濃度鼠李糖脂的土壤樣品降解率最高，降解率為67.4％
　　(3)三種堆肥方式均可有效降解總石油烴(TPH)，強(qiáng)化堆肥（表面活性劑強(qiáng)化堆肥和復(fù)合菌群強(qiáng)化堆肥）降解效

6、率高于自然堆肥。在42天堆肥結(jié)束時(shí)自然堆肥、表面活性劑強(qiáng)化堆肥和復(fù)合菌群強(qiáng)化堆肥中TPH降解率分別為69％88％和80％，降解半衰期為23d、14d和18d。堆肥過程中，強(qiáng)化堆肥各時(shí)期細(xì)菌數(shù)量均明顯高于自然堆肥，細(xì)菌的數(shù)量級達(dá)到109CFU/g，而自然堆肥中細(xì)菌的數(shù)量級為108CFU/g，同時(shí)，強(qiáng)化堆肥中高溫期持續(xù)11d以上，自然堆肥中高溫期僅持續(xù)7d，這表明強(qiáng)化堆肥均可通過促進(jìn)微生物的代謝和繁殖來提高石油污染物的降解速率。TPH測定結(jié)

7、果還表明:不同堆肥方式中烴降解的規(guī)律不同，自然堆肥中腐熟期TPH降解速度最快，表面活性劑強(qiáng)化堆肥中降溫期TPH降解速度最快，而復(fù)合菌群強(qiáng)化堆肥中TPH降解最快時(shí)期出現(xiàn)在高溫期，但三種堆肥方式中石油降解過程均符合一級反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程。GC-FID分段分析表明，兩種強(qiáng)化堆肥可降解的原油優(yōu)勢組分不同，表面活性劑強(qiáng)化堆肥中對烷烴的降解更有利，復(fù)合菌群強(qiáng)化堆肥中對芳香烴類的降解更有利。
　　(4)細(xì)菌16SrDNA高通量測序分析表明，三種不同

8、方式的堆肥中微生物群落豐富度和多樣性變化趨勢一致，即高溫期微生物群落豐富度和多樣性最少，進(jìn)入降溫期和腐熟期逐漸增加，而且在整個(gè)堆肥過程中兩種強(qiáng)化堆肥中微生物群落豐富度和多樣性均高于自然堆肥。在堆肥中降溫期和腐熟期，表面活性劑強(qiáng)化堆肥Simpson指數(shù)分別為5.22和5.48，復(fù)合菌群強(qiáng)化堆肥Simpson指數(shù)分別為5.10和5.26，均高于自然堆肥（4.98和5.12）。聚類分析表明，三種方式堆肥中高溫期和降溫期細(xì)菌群落組成結(jié)構(gòu)差異顯著

9、，而腐熟期細(xì)菌群落組成結(jié)構(gòu)相似。測序結(jié)果表明三種方式堆肥中的細(xì)菌屬于28個(gè)門，其中5個(gè)優(yōu)勢菌門為Proteobacteria、Firmicutes、 Bacteroidetes、 Chloroflexi、Actinobacteria。在綱水平上屬于21個(gè)綱，其中9個(gè)優(yōu)勢綱為Bacilli、Actinobacteria、γ-Proteobacteria、α-Proteobacteria、 Anaerolineae、 Cytophagia、

10、Flavobacteriia和Clostridia。在屬水平上對豐度前40的屬統(tǒng)計(jì)分析，其中與石油烴降解有關(guān)的菌屬有12個(gè)。自然堆肥中豐度較高的烴降解菌屬為Rhodococcus sp.、Bacillus sp.和Steroidobacter sp.，顯著性分析表明，TPH降解速率與Rhodococcus sp.和Steroidobacter sp.呈顯著正相關(guān)(P＜0.05);表面活性劑強(qiáng)化堆肥中豐度較高的烴降解菌為Pseudomon

11、as sp.、Flavobacterium sp.、Pusillimonas sp.和Mycobacteriu sp.，TPH降解速率與Pseudomonas sp.和Flavobacterium sp.呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)，同時(shí)與Pusillimonas sp.正相關(guān)性較大;復(fù)合菌群強(qiáng)化堆肥中豐度較高的烴降解菌為Pseudomonas sp.、Bacillus sp.、Lysinibacillus sp.和Gordonia s

12、p.，TPH降解速率與Pseudomonas sp.顯著正相關(guān)(P＜0.05)，與Gordonia sp.顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。
　　(5)建立了堆肥樣品的AlkB基因克隆文庫，共得到466條序列，分析獲得12個(gè)OPFs。AlkB的α多樣性分析表明，兩種強(qiáng)化堆肥中的AlkB基因多樣性均高于自然堆肥。不同堆肥方式中優(yōu)勢OPF不同，自然堆肥中OPF6（相似序列Rhodococcus erythropolis AlkB）和OPF2

13、（Rhodococcus qingshengii BKS20-40 AlkB）為優(yōu)勢OPF，表面活性劑強(qiáng)化堆肥中優(yōu)勢OPF為OPF12(Flavobacteriales bacterium ALC-1 AlkB)和OPF8(Pseudomonas aeruginosa AlkB),復(fù)合菌群強(qiáng)化堆肥中OPF5（Pseudomonas sp.D86 AlkB）為優(yōu)勢OPF，三種堆肥方式中優(yōu)勢OPF的最相似菌屬均與16SrDNA高通量測序時(shí)與