糖尿病大鼠牙周組織病理改變的機制研究.pdf

1、糖尿病(DM,Diabetes Mellitus)是一種多病因的代謝性疾病,特點是慢性高血糖,伴隨因胰島素分泌及/或作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂。糖尿病包括兩種類型 1 型即胰島素依賴型(insulin-dependent-diabetes mellitus,IDDM)和2 型即非胰島素依賴型(non-insulin-dependent-diabetes mellitus,NIDDM)。目前糖尿病已經(jīng)成為危害大眾健康的主要疾病

2、之一。糖尿病患者在世界范圍內(nèi)正在迅猛增加,預(yù)計到2030年糖尿病患者將達(dá)到 3 億,糖尿病及其伴隨的并發(fā)癥日益受到人們重視,糖尿病可影響牙齦炎和牙周炎的發(fā)生發(fā)展:1 型糖尿病兒童牙齦炎發(fā)生率顯著高于非糖尿病患者,其牙齦發(fā)生炎癥的位點是非糖尿病患者的兩倍,有研究表明糖尿病患者牙周病發(fā)生率為 75％。血糖水平影響牙周組織病變的嚴(yán)重程度,血糖控制不良患者牙周組織破壞更嚴(yán)重,且更容易出現(xiàn)不易愈合的牙周病損。
　　 牙周炎是由菌斑微生物引

3、起的慢性感染性疾病,主要表現(xiàn)為牙齦炎癥、牙槽骨吸收、附著喪失、牙松動。是成人牙缺失的主要因為。牙周炎的病因除菌斑牙石等局部刺激因素外,還受到全身健康狀況如妊娠不良、心血管疾病、糖尿病等的影響。由以糖尿病對牙周組織的影響倍受關(guān)注。
　　 糖尿病與牙周炎關(guān)系密切,二者均是多因素共同作用的疾病,糖尿病本身不引起牙周炎,但由于糖尿病產(chǎn)生的糖代謝紊亂、微血管病變,糖激化終末產(chǎn)物以及糖尿病對牙菌群、中性粒細(xì)胞功能、炎癥反應(yīng)強度及組織愈合能力

4、的影響,均可導(dǎo)致牙周微循環(huán)障礙,促進(jìn)牙周炎的發(fā)生發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病人群中,牙周病的發(fā)病率高,病變損害嚴(yán)重且進(jìn)展迅速。2 型糖尿病患者牙周炎發(fā)病率是非糖尿病患者的3 倍左右。動物模型研究表明糖尿病大鼠破骨細(xì)胞數(shù)量,活性遠(yuǎn)高于正常大鼠,糖尿病可引起持續(xù)更久的炎癥反應(yīng),更多的附著喪失,更嚴(yán)重的牙槽骨吸收,使骨修復(fù)能力明顯受損,防礙新骨形成。糖尿病與牙周炎呈雙向關(guān)系,一方面血糖升高是牙周炎的危險因素,另一方面牙周炎做為局部疾病對全身組織或器官

5、產(chǎn)生影響,牙周感染產(chǎn)生的炎癥因子如 TNF-α 進(jìn)入系統(tǒng)循環(huán),可引起胰島素抵抗。研究表明牙周的非手術(shù)治療對糖尿病患者的血糖控制有一定的影響。
　　 糖尿病患者常伴隨牙槽骨吸收,研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠牙槽骨骨吸收活躍,骨皮質(zhì)變薄,其表面成骨細(xì)胞數(shù)目減少,很少見新骨形成,2型糖尿病患者發(fā)生牙槽骨吸收的危險性是非糖尿病患者的4 倍。研究發(fā)現(xiàn) RANKL/OPG 與牙周炎牙槽骨吸收有密切聯(lián)系。核因子 kB 受體活化因子配體(receptor

6、 activator ofnuclear factor-kB ligand,RANKL)是腫瘤壞死因子配體超家族成員,來源于巨噬細(xì)胞,成纖維細(xì)胞,成骨細(xì)胞和T 細(xì)胞?？山Y(jié)合于前體破骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞表面,促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化成熟,誘發(fā)骨吸收。骨保護(hù)素(osteoprotegerin,OPG)是腫瘤壞死因子受體超家族成員,該蛋白與骨密度及骨含量有關(guān),過度表達(dá)該蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠骨質(zhì)堅硬,敲除該基因的小鼠會發(fā)生嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松。OPG的主要作用是影

7、響骨代謝,抑制破骨細(xì)胞的發(fā)生、分化、活化成熟及促進(jìn)其凋亡。OPG 是 RANKL的天然抑制劑,可競爭性的抑制 RANKL 與核因子 kB 受體活化因子(receptor activator of nuclear factor-kB,RANK)的結(jié)合,從而抑制骨吸收。OPG/RANKL/RANK 是破骨細(xì)胞活化的分子基礎(chǔ),RANKL 與 OPG的變化影響破骨細(xì)胞的形成和活化,從而影響骨吸收。
　　 糖尿病患者存在特異與非特異免疫功

8、能異常,牙周炎的發(fā)生發(fā)展亦與免疫異常有關(guān)。而 CD4,CD8 是重要的免疫細(xì)胞,二者之間的平衡對于維持機體免疫應(yīng)答起作用。
　　 本實驗在沒有外界刺激因素作用下,通過檢測 CD4,CD8 在大鼠牙周組織的表達(dá)改變分析糖尿病狀態(tài)下牙周組織免疫細(xì)胞功能的變化,通過檢測RANKL,OPG 在大鼠牙周組織中的改變情況,分析糖尿病對大鼠牙槽骨的影響。探討糖尿病大鼠牙周組織病理改變的可能機制。
　　 目的
　　 1 了解糖尿

9、病狀態(tài)下大鼠牙周組織的形態(tài)學(xué)改變；
　　 2 了解糖尿病狀態(tài)下大鼠牙周組織細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能的改變；
　　 3 通過了解牙周組織 RANKL,OPG 改變情況分析糖尿病大鼠牙槽骨吸收的可能風(fēng)險。方法:
　　 1 建立糖尿病大鼠模型
　　 SD 大鼠隨機分成兩組:糖尿病組(DM n=30)和正常對照組(N n=8)。糖尿病大鼠高熱量飼料喂養(yǎng) 1 個月后,建立肥胖模型,然后一次性靜脈注射鏈脲佐菌素(strept

10、ozotocin,STZ)(55mg/kg),建立糖尿病模型；對照組大鼠普通飼料喂養(yǎng) 1個月后,一次性靜脈注射 0.1mol/L,pH4.5 相同劑量的檸檬酸緩沖液；檢測血糖、尿糖改變情況。糖尿病大鼠模型成功的標(biāo)準(zhǔn)為空腹?fàn)顟B(tài)下(禁食 8 小時)血糖值≥11.2mmol/L,尿糖為+++,24 小時飲水量>50ml,體重下降且這些癥狀持續(xù)兩周。
　　 2 檢查牙周情況
　　 于實驗開始的第 16 周,3％戊巴比妥鈉麻醉兩組

11、大鼠,觀察兩組大鼠牙齦的顏色、形狀、質(zhì)地、有無出血及牙齦退縮情況,用牙周探針探查大鼠牙周組織附著水平。
　　 3 牙周組織形態(tài)學(xué)觀察
　　 按實驗分組,于實驗開始的16 周后在戊巴比妥鈉麻醉下,行腹主動脈或內(nèi)眥靜脈放血處死大鼠,解剖上頜骨,4％多聚甲醛溶液固定24小時(4℃),EDTA(pH=7.4)液脫鈣兩周,洗滌,脫水,透明,浸蠟,石蠟包埋,制成 3um 厚連續(xù)切片,石蠟切片常規(guī)脫蠟,脫水,HE 染色,光鏡視野下觀察

12、,采集圖像。
　　 4 大鼠牙周組織 CD4,CD8的免疫組織化學(xué)
　　 糖尿病組及正常組大鼠石蠟切片脫蠟,復(fù)水,3％過氧化氫液滅活內(nèi)源性過氧化物酶,枸櫞酸鹽緩沖液行熱修復(fù),10％山羊血清封閉,小鼠抗大鼠 CD4,CD8 單克隆抗體按 1:100 稀釋,37℃恒溫箱孵育1小時,加入 FITC 標(biāo)記羊抗小鼠 IgG(1:50稀釋),37℃恒溫箱孵育30分,激光掃描共聚焦顯微鏡采集圖像,行灰度值分析。
　　 5 大鼠

13、牙周組織 RANKL,OPG的免疫組織化學(xué)
　　 糖尿病組及正常組大鼠石蠟切片脫蠟,復(fù)水,3％過氧化氫液滅活內(nèi)源性過氧化物酶,枸櫞酸鹽緩沖液行熱修復(fù),10％山羊血清封閉,兔抗大鼠 RANKL,OPG單克隆抗體按 1:100 稀釋,37℃恒溫箱孵育 1 小時,加FITC 標(biāo)記羊抗兔 IgG(1:50 稀釋),37℃恒溫箱孵育 30 分鐘,激光掃描共聚焦顯微鏡采集圖像,行灰度值分析。
　　 6 統(tǒng)計學(xué)處理
　　 應(yīng)用

14、 SPSS17.0 做統(tǒng)計分析處理,結(jié)果以(X)±s 表示,方差齊性的樣本采用獨立樣本t,方差不齊樣本采用 t’檢驗。p<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1 實驗動物一般情況
　　 除糖尿病組 2 只大鼠死亡外,其余大鼠精神狀態(tài)良好,活動自如,糖尿病組在注射 STZ 一周后尿糖增高,血糖值均高于 11.2mmol/L,尿糖增高為+++,且出現(xiàn)多飲,體重下降,正常組血糖無明顯變化。
　　

15、 2 牙周組織情況
　　 糖尿病組和對照組大鼠牙齦形狀、質(zhì)地沒有明顯異常,未發(fā)現(xiàn)牙齦萎縮,牙周探診水平維持在初始水平,但糖尿病組大鼠牙齦顏色輕微發(fā)紅,牙齦出血指數(shù)較對照組稍偏高
　　 3 HE 染色觀察
　　 糖尿病組大鼠牙周組織 HE 染色可見牙周膜纖維排列紊亂,破骨細(xì)胞形成。對照組大鼠膠原纖維排列整齊,未見破骨細(xì)胞。
　　 4 牙周組織 CD4,CD8 熒光免疫組織染色結(jié)果
　　 糖尿病組 C

16、D4 表達(dá)高于對照組(t=4.167 p=0.001),差異有統(tǒng)計學(xué)意義；糖尿病組 CD8 表達(dá)高于對照組(t=2.971 p=0.008),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 5 牙周組織 RANKL,OPG 熒光免疫組織染色結(jié)果
　　 糖尿病組 RANKL 表達(dá)高于對照組(t=-5.348 p=0.000),差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與正常對照組相比,OPG 表達(dá)降低,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=-1.806 p=0.090)。
　　

17、 結(jié)論:
　　 1 糖尿病組大鼠 HE 染色出現(xiàn)破骨細(xì)胞,骨吸收陷窩及排列紊亂的膠原纖維,提示糖尿病雖然不能造成牙周組織實質(zhì)性損害,但在一定程度上改變了牙周組織結(jié)構(gòu),影響其支持功能和防御功能,可能導(dǎo)致其抗感染能力下降。
　　 2 糖尿病大鼠牙周組織 CD4,CD8 細(xì)胞表達(dá)水平高于對照組,提示糖尿病大鼠牙周組織細(xì)胞免疫功能可能出現(xiàn)變化,存在免疫調(diào)節(jié)功能和T 細(xì)胞活化異常。
　　 3 與正常對照組相比,糖尿病組大