鼻咽癌血清肽差異表達(dá)模式及血清miRNA分子標(biāo)志物篩選.pdf

1、背景：惡性腫瘤難以治愈的主要原因是早期不容易被發(fā)現(xiàn)，一旦出現(xiàn)明顯癥狀就診，大多數(shù)已經(jīng)到中晚期，伴有較廣泛的浸潤(rùn)或轉(zhuǎn)移，臨床治療效果差。目前，最佳抗腫瘤治療策略仍然有賴于早期發(fā)現(xiàn)及密切監(jiān)測(cè)早期復(fù)發(fā)。尋找方便有效的腫瘤早期診斷分子標(biāo)志物和方法，一直是腫瘤研究亟待解決的問題。血液天然反映著機(jī)體的生理和病理狀態(tài)，且血液標(biāo)本較易獲取，是尋找疾病分子標(biāo)志物最理想的材料。鼻咽癌在歐美等西方國(guó)家罕見，而在我國(guó)高發(fā)，鼻咽癌也被形象的稱為“中國(guó)癌”。鼻咽癌

2、發(fā)病隱秘，早期沒有明顯臨床表現(xiàn)，不容易發(fā)現(xiàn)，且鼻咽癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生早。因此，鼻咽癌早期診斷在我國(guó)尤為重要。由于鼻咽癌與EB病毒感染存在一定相關(guān)性，目前，臨床上針對(duì)鼻咽癌的篩查主要是檢測(cè)血液中EB病毒感染情況，如EBV-DNA、EBV-VCA-IgA等檢測(cè)。但鼻咽癌與EBV并非完全相關(guān)，且許多疾病(如淋巴瘤、胃癌、乳腺癌、咽炎、傳染性單核細(xì)胞增多癥等)都可伴有EBV感染，健康人群也有一定比例感染者，大量的臨床實(shí)踐證明，EBV相關(guān)檢測(cè)診斷鼻

3、咽癌的靈敏度與特異性都不高，達(dá)不到作為早期診斷標(biāo)志物的要求。腫瘤本身就是組織微環(huán)境的產(chǎn)物，腫瘤與微環(huán)境之間相互影響，組織微環(huán)境的多肽成分可以進(jìn)入血液循環(huán)。血清中包含大量的低分子肽，這些肽受到機(jī)體生理和病理狀態(tài)的影響，天然的“記錄”著機(jī)體的生理和病理信息。因此，血清肽很可能是進(jìn)行疾病血液學(xué)診斷的良好資源，昔日認(rèn)為是生物垃圾的血清肽如今成了“診斷黃金”。在多種腫瘤中，血清肽的研究也正在興起。miRNA是一種非編碼小RNA，在基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控

4、中發(fā)揮巨大作用。miRNA的異常表達(dá)在許多疾病中扮演重要角色，特別是在腫瘤性疾病中，miRNA的意義尤其重要。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，血清中存在miRNA，血清miRNA的表達(dá)受疾病的影響，且這些miRNA十分穩(wěn)定，具有成為疾病標(biāo)志物的天然優(yōu)勢(shì)，是十分有應(yīng)用前景的疾病診斷標(biāo)志物。
　　 目的：本研究擬通過對(duì)鼻咽癌患者血清和非癌人群血清的血清肽譜和血清miRNA表達(dá)譜進(jìn)行比較研究，經(jīng)過篩選、驗(yàn)證，尋找差異表達(dá)血清肽(表達(dá)模式)和血清mi

5、RNA，并建立鼻咽癌血清肽和血清miRNA診斷模型或判別方程，為鼻咽癌早期診斷、病情監(jiān)測(cè)和預(yù)后提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并可能為治療提供思路和靶點(diǎn)。
　　 方法：1.制定血清采集的標(biāo)準(zhǔn)程序按照標(biāo)準(zhǔn)程序廣泛收集鼻咽癌患者(包括治療前、一個(gè)療程后)血清和非癌人群血清標(biāo)本，完善基本資料和相關(guān)臨床資料，建立血清樣本庫(kù)；2.使用EBV-VCA-IgA ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)所有血清標(biāo)本中EBV的感染情況；3.運(yùn)用WCX磁珠固相分離與MALDI-TO

6、F質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合的方法，獲得鼻咽癌血清肽譜和非癌血清肽譜，對(duì)其二組血清肽譜進(jìn)行比較研究，使用Clinpro Tools軟件和CARS(competitive adaptive reweighted sampling)算法建立鼻咽癌血清肽診斷模型(判別方程)，同時(shí)觀察不同臨床階段鼻咽癌血清肽譜和鼻咽癌治療前后血清肽變化情況；通過隨訪，分析血清肽表達(dá)模式與預(yù)后的關(guān)系；4.通過TaqMan Low-Density array(TLDA)miR

7、NA芯片獲取鼻咽癌患者血清和非癌人群血清的miRNA表達(dá)譜，通過比較分析和定量PCR驗(yàn)證篩選鼻咽癌差異表達(dá)血清miRNA；建立鼻咽癌血清miRNA診斷模型，并驗(yàn)證診斷模型的診斷效率；隨訪患者，采用Kaplan-Meier法分析鼻咽癌差異表達(dá)血清miRNA與預(yù)后的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：1.收集了一定量的鼻咽癌血清樣本和非癌血清樣本，初步建立了資料齊全的血清樣本庫(kù)；2.通過EBV-VCA-IgA檢測(cè)得到非癌血清樣本EBV陽(yáng)性率為11

8、.4％，鼻咽癌患者血清樣本EBV陽(yáng)性率為66.2％，差異有高度顯著性。3.在正式實(shí)驗(yàn)前，通過磁珠-質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)條件摸索，發(fā)現(xiàn)了一系列影響結(jié)果的實(shí)驗(yàn)條件，制訂了合理可靠的磁珠-質(zhì)譜方法實(shí)驗(yàn)流程；4.通過不同年齡段和不同性別血清肽的比較研究，發(fā)現(xiàn)年齡對(duì)血清肽譜有較大影響，性別對(duì)血清肽譜的影響相對(duì)較??；5.獲得了基于WCX磁珠和MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)的鼻咽癌血清肽譜和非癌人群血清肽譜。6.使用Clinpro Tools建立鼻咽癌血清肽診斷模型

9、，外部驗(yàn)證其特異性為85.7％、靈敏度為80.7％；7.運(yùn)用CARS算法建立鼻咽癌的診斷判別方程：Y=0.2884X1+0.2073X2-0.2223 X3+0.3985 X4+0.2446 X5(X1:1741.10Da；X2:2991.11Da；X3:3192.36Da；X4:3890.71Da；X5：5064.67Da)，其特異性為84.08％，靈敏度為93.50％，曲線下面積(AUC)為0.9425；8.通過對(duì)不同臨床階段鼻咽癌

10、血清肽譜的比較分析發(fā)現(xiàn)，血清肽的改變主要發(fā)生在正常-早期鼻咽癌過程中，鼻咽癌各個(gè)臨床階段之間血清肽表達(dá)模式無明顯差異；9.鼻咽癌治療前后血清肽表達(dá)模式有較小差異；10.EBV陽(yáng)性和陰性鼻咽癌血清肽譜無明顯差異；11.生存曲線分析提示3890Da血清肽與預(yù)后存在相關(guān)性；12.使用TLDA芯片獲得了鼻咽癌患者和非癌人群血清miRNA表達(dá)譜，分別檢測(cè)到103個(gè)和125個(gè)miRNA表達(dá)；13.對(duì)鼻咽癌患者和非癌人群血清miRNA表達(dá)譜進(jìn)行比較分

11、析和驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)miR-17、miR-20a、miR-486-3p在鼻咽癌血清中表達(dá)升高，miR-29c、miR-223在鼻咽癌血清中表達(dá)下降。14.建立了鼻咽癌血清miRNA診斷模型：A=(CtmiR-29c+CtmiR-223)-(CtmiR-17+CtmiR-20a)>-3.30(即A>-3.30診斷為鼻咽癌；A<-3.30診斷為非癌)，其靈敏度和特異性在96％以上。15.生存曲線分析提示血清miR-20a與預(yù)后存在相關(guān)性。