HMGB1在豬流行性腹瀉病毒感染中作用機制的研究.pdf

1、豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemicdiarrhea virus，PEDV)引起的一種以水樣腹瀉、嘔吐、脫水為主要特征的豬腸道傳染性疾病，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。盡管對PEDV致病機制進行了一定的研究，取得了一系列有重要意義的成果，但在病毒的侵染機制及與宿主細胞之間的相互作用機制等方面，研究的較少，是近年來被廣泛研究的熱點。本研究主要針

2、對HMGB1在PEDV感染中作用機制進行了深入探討，系統(tǒng)分析了PEDV感染與宿主蛋白HMGB1相互關(guān)系的機制。主要研究內(nèi)容包括:
　　1.甘草素對PEDV的抗病毒效果
　　甘草素是一個來源于傳統(tǒng)中藥甘草的天然產(chǎn)物。通過western blot、熒光定量PCR和噬斑形成試驗證明了甘草素具有抑制PEDV感染Vero細胞的效果。此外，探索了甘草素抑制PEDV感染的作用過程，發(fā)現(xiàn)甘草素對PEDV的入胞和復(fù)制有影響，而對細胞、病毒粒子

3、本身、病毒的組裝和釋放沒有影響。
　　2.HMGB1在甘草素的抗病毒過程中起著重要的作用
　　HMGB1是一個細胞中含量非常豐富的核蛋白，能作為一個重要的炎性介質(zhì)釋放到胞外空間調(diào)節(jié)宿主的炎癥反應(yīng)。我們發(fā)現(xiàn)甘草素能降低由PEDV感染引起的促炎性因子(IL-1β，IL-6，IL-8，TNF-α)的升高，且Poly(I∶C)引起促炎性因子的升高且促進了PEDV的感染。甘草素是HMGB1的競爭性抑制劑。通過HMGB1抗體中和試驗和s

4、iRNA干擾HMGB1表達，發(fā)現(xiàn)HMGB1在感染條件下對促炎性因子的升高起著重要的作用。HMGB1可與TLR4和RAGE等受體相結(jié)合，因此利用TLR4的抑制劑和RAGE的siRNA處理細胞，發(fā)現(xiàn)TLR4抑制劑和siRAGE能降低促炎性因子的升高和病毒的感染，且過表達HMGB1的突變體(PCA-C45S、PCA-C106S、PCA-C45106S)可降低促炎性因子的升高和PEDV的感染。此外，我們還證明了HMGB1與TLR4和RAGE結(jié)合

5、后可激活P38MAPK來誘導促炎性因子的升高進而有利于PEDV的感染。總之，甘草素與胞外HMGB1結(jié)合后，降低了其與TLR4和RAGE受體的結(jié)合，從而降低了P38MAPK的激活，使促炎性因子降低來抑制PEDV的增殖。
　　3.硫酸類肝素是豬流行性腹瀉病毒感染Vero細胞的吸附因子
　　許多病毒利用硫酸類肝素作為它們的吸附因子。在該研究中，證明了PEDV利用硫酸類肝素吸附Vero細胞。Western blot分析、熒光定量PC

6、R和噬斑形成試驗揭示被肝素預(yù)處理的病毒，其感染細胞的能力受到抑制;而用肝素預(yù)處理細胞，對PEDV的感染沒有抑制效應(yīng)。其次，我們發(fā)現(xiàn)肝素酶Ⅰ處理細胞去除硫酸類肝素后，細胞對PEDV的易感性下降。另外，我們證明抑制硫酸類肝素生物合成的氯酸鈉處理細胞，能夠有效抑制PEDV的感染。我們還檢測了不同程度硫酸化的兩個肝素類似物對PEDV感染的影響，數(shù)據(jù)表明N-去硫酸化肝素（不是N-乙酰化O-去硫酸化肝素）預(yù)處理病毒能夠降低病毒感染細胞的能力。此外，

7、肝素可抑制PEDV的復(fù)制和HMGB1mRNA水平?？傊芯勘砻髁蛩犷惛嗡厥荘EDV感染Vero細胞的吸附因子。
　　4.PEDV N蛋白通過與C/EBP-β相互作用來正調(diào)HMGB1的轉(zhuǎn)錄及乙?；歪尫?br>　　HMGB1是一個重要的促炎性介質(zhì)并且促進多種炎性疾病的發(fā)生。發(fā)現(xiàn)了PEDV感染導致HMGB1的乙?；歪尫?，PEDV的感染和PEDV衣殼蛋白通過SIRT1、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶和NF-κB調(diào)節(jié)HMGB1的乙酰化。過表達PED

8、V N蛋白能促進HMGB1的乙酰化和釋放。CHIP試驗表明PEDV N能與HMGB1啟動子區(qū)DNA相互作用。雙熒光素酶報告基因試驗證明了PEDV N蛋白介導的HMGB1的轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄因子C/EBP結(jié)合基序有關(guān)。用Co-IP試驗進一步表明病毒的衣殼蛋白與C/EBP-β相互作用來正調(diào)HMGB1基因的轉(zhuǎn)錄。總之，PEDV感染能引起HMGB1的乙酰化和釋放，且主要是PEDVN蛋白起作用。我們的結(jié)果對PEDV的發(fā)病提供了新的視角并且為發(fā)展以HMGB

9、1為靶點的治療方法和藥物提供了理論基礎(chǔ)。
　　5.豬流行性腹瀉病毒通過DNA損傷引起HMGB1的釋放
　　由DNA病毒激活的DNA損傷反應(yīng)被廣泛的研究。然而，RNA病毒引起DNA損傷反應(yīng)的研究很少。因此通過western blot和間接免疫熒光揭示了PEDV快速激活H2AX的磷酸化，且HY增加了PEDVN蛋白的表達。此外，通過western blot、qRT-PCR和噬斑形成試驗證明DNA-PK抑制劑(NU7441)和ATM

10、抑制劑（KU-55933）抑制了HMGB1的釋放和PEDV的感染，且DNA-PK的抑制劑效果更好。但是ATR的抑制劑（VE-821）對PEDV感染沒有影響。此外，PEDV引起PARP1的激活，PARP1的抑制劑3-AB抑制了HMGB1的釋放及PEDV的感染。DNA-PK抑制劑(NU7441)和ATM抑制劑(KU-55933)抑制了PARP1的活性，表明PEDV主要通過誘導DNA-PK依賴的DNA損傷和部分ATM依賴的DNA損傷激活PAR