重組hGSTP1蛋白入胞機(jī)制的研究.pdf

1、GSTP1(GSTπ)是人體內(nèi)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的一種重要的活性亞型,因其首先在人體胎盤(placenta)中被克隆而得名。GSTP1在多種腫瘤組織細(xì)胞和轉(zhuǎn)化的細(xì)胞株中豐度極高,且與腫瘤細(xì)胞的耐藥性密切相關(guān)。對(duì)GSTP1的早期研究集中于分子空間結(jié)構(gòu)及其多態(tài)性和催化活性與上述人類疾病的關(guān)系,是目前所有人類GSTs中研究最為廣泛和深入的一種亞型。GSTP1屬于機(jī)體內(nèi)源性蛋白,不會(huì)引起免疫原反應(yīng),在維持細(xì)胞的正常機(jī)能中發(fā)揮著重要作

2、用,也是一種具有臨床應(yīng)用價(jià)值的抗氧化劑。
　　 本實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)GSTP1在LPS引起的炎癥中具有負(fù)向調(diào)控的功能,通過下調(diào)相關(guān)的信號(hào)通路減少炎癥因子的過量產(chǎn)生。在小鼠巨噬樣細(xì)胞株RAW264.7中,LPS刺激能上調(diào)內(nèi)源性GSTP1的Mrna轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平。在細(xì)胞內(nèi)通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的手段過表達(dá)GSTP1,過表達(dá)的GSTP1以劑量和時(shí)間依賴性地抑制了LPS激活的MAPKs,包括ERK、JNK和p38,以及NF-

3、Κb信號(hào)通路。此外還發(fā)現(xiàn),通過抑制上游的信號(hào)通路,GSTP1抑制了TNF-α和-氧化氮(NO)的合成和釋放。并發(fā)現(xiàn)外源性的GSTP1蛋白可以抑制LPS刺激Inos與COX-2的大量表達(dá),動(dòng)物模型上的結(jié)果表明,通過腹腔注射GSTP1蛋白可以有效地抑制全身炎性反應(yīng)。有文獻(xiàn)報(bào)道GSTP1不僅作為胞內(nèi)酶在細(xì)胞中發(fā)揮作用,GSTP1作為胞內(nèi)主要的Ⅱ期代謝酶類可以存在于細(xì)胞外,這表明它可以進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。在本課題中,就是對(duì)GSTP1蛋白的入胞機(jī)制進(jìn)行

4、具體研究,發(fā)現(xiàn)外源重組的GSTP1以跨膜進(jìn)入RAW264.7細(xì)胞本實(shí)驗(yàn)中,我們通過免疫印跡與流式細(xì)胞術(shù)觀察到,培養(yǎng)液中添加的GSTP1蛋白可以進(jìn)入小鼠巨噬樣細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞和人胚腎細(xì)胞株293細(xì)胞,這提示我們胞外的GSTP1蛋白可以轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)在胞漿中發(fā)揮作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明外源的GSTP1的入胞隨濃度的增加而提高,無血清培養(yǎng)比有血清培養(yǎng)入胞效率高。在具體的入胞機(jī)制研究中,應(yīng)用各種內(nèi)吞機(jī)制劑,發(fā)現(xiàn)能抑制網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用的氯丙

5、嗪對(duì)GSTP1入胞基本沒有影響,細(xì)胞松弛素D是肌動(dòng)蛋白延伸的抑制劑,因而能抑制細(xì)胞的吞噬作用和巨胞飲作用,但甲基-β-環(huán)糊精能抑制脂筏途徑,在該種藥物處理后,GSTP1的入胞明顯受到抑制,說明GSTP1以脂筏介導(dǎo)的方式進(jìn)入RAW264.7細(xì)胞我們發(fā)現(xiàn),GSTP1以脂筏介導(dǎo)的方式進(jìn)入RAW264.7細(xì)胞,并具有溫度和能量依賴性。
　　 綜上,我們可以通過增加外源性的GSTP1蛋白來提高胞內(nèi)GSTP1的水平,從而有效抑制與急性炎癥反