HIV-1 Gag蛋白的重組、表達(dá)與應(yīng)用.pdf

1、獲得性免疫缺陷綜合癥(acquired immunoceficiency syndrome,AIDS)是當(dāng)今世界影響最大,危害也最大的疾病之一,它的防治迫在眉睫.人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)是AIDS的病原體,其中編碼核心蛋白的gag基因是HIV基因中最保守的一段.含有p24和p17的核心蛋白,又稱Gag蛋白具有一定的抗原性,而且抗Gag蛋白的抗體是HIV感染后可從血液中最早檢出的

2、抗體,因此HIV-Gag蛋白對(duì)AIDS的檢測(cè)有著重要的作用.該文主要是對(duì)HIV-gag基因的重組、表達(dá)和應(yīng)用進(jìn)行了研究.目的 研制HIV抗體診斷試劑.方法 根據(jù)從Genbank上查詢到的HIV-gag基因的序列,分別設(shè)計(jì)了上游引物(gagF):5'-CGGATCCA ATG GGT GCG AGA GCG TCA-3'和下游引物(gagR):5'-CGGAATTCGT GTC GTT GCC AAA GAG TGA-3'.用聚合酶鏈反應(yīng)

3、(PCR)的方法從HIV-1的基因中擴(kuò)增出gag的DNA.經(jīng)BamH I和EcoR Ⅰ雙酶切后,用T4 DNA連接酶將gag的DNA插入表達(dá)載體pTrcHis2A質(zhì)粒中,構(gòu)成重組的gag-pTrcHis2 A質(zhì)粒.將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原核表達(dá)菌株BL21(DE3)中,用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá).表達(dá)的蛋白用Ni<'2+>親和層析柱純化后做SDS-PAGE檢測(cè),以及蛋白印跡(Western blot,Wb)和間接ELI

4、SA實(shí)驗(yàn)的應(yīng)用研究.結(jié)果 SDS-PAGE電泳顯示,表達(dá)的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為41kD,與預(yù)計(jì)的值相同;蛋白印跡實(shí)驗(yàn)顯示,陽(yáng)性血清和陰性血清的檢出符合率分別為100％(10/10)和100%(40/40);ELISA實(shí)驗(yàn)顯示,10ng重組的Gag抗原與稀釋了100倍的血清反應(yīng),陽(yáng)性血清和陰性血清的檢出符合率分別為100%(10/10)和100%(80/80).結(jié)論 所研制的重組Gag蛋白正確表達(dá),而且具有較高的抗原特異性和敏感性,可用于制