嗜水氣單胞菌鑒定、重組外膜蛋白W的制備及免疫原性研究.pdf

1、草魚(Ctenopharyngodon idellus)是我國淡水養(yǎng)殖的“四大家魚”之一，一直以來是中國大部分地區(qū)的主養(yǎng)品種，在我國農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)中具有重要的意義。由于高密度養(yǎng)殖以及水質(zhì)環(huán)境的日益惡化，草魚養(yǎng)殖過程病害的發(fā)生日趨嚴(yán)重，其中嗜水氣單胞菌所致的草魚敗血病是危害最大的細(xì)菌性疾病之一.本研究采用傳統(tǒng)理化鑒定方法與分子生物學(xué)鑒定方法，對患病草魚的嗜水氣單胞菌分離株進(jìn)行分類鑒定，并進(jìn)行其毒力基因的鑒定。同時(shí)研制重組嗜水氣單胞菌的外膜蛋白W

2、，為草魚敗血病基因工程業(yè)單位疫苗的制備提供理論依據(jù)。
　　 1.草魚嗜水氣單胞菌的分離與鑒定
　　 本研究從患暴發(fā)性敗血病的草魚肝臟病灶處分離了2株致病菌，分別命名為Wp3和Zcl，通過人工回歸感染實(shí)驗(yàn)顯示分離菌株能使草魚致病死亡。對分離菌株進(jìn)行形態(tài)觀察、選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)和理化特性分析，初步判定所分離的2株菌均為嗜水氣單胞菌。進(jìn)一步對菌株進(jìn)行DNA分子鑒定，結(jié)果顯示2株菌的16SrRNA基因、促旋酶亞單位蛋白(gryB)

3、基因均與GenBank上的嗜水氣單胞菌相應(yīng)的基因具有高度的同源性。在根據(jù)已知序列構(gòu)建的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹中2株菌均與嗜水氣單胞菌聚類。同時(shí)2個(gè)菌株均可擴(kuò)增到氣溶素基因(aerA)和絲氨酸蛋白酶基因(ahpA)，提示它們均可能為嗜水氣單胞菌強(qiáng)毒株。
　　 2.嗜水氣單胞菌毒力因子基因的分析
　　 選取Wp3菌株，克隆該菌株的氣溶素(aerolysin，aerA)基因和溶血素(hemolysin，h1yA)基因，序列分析顯示這二

4、個(gè)基因只有46.7％的同源性。B1ast分析顯示，h1yA基因與GenBank上已登錄的h1yA序列具有較高的同源性，而aerA基因與已登錄的aerA基因以及一些h1yA序列也具有較高的同源性。對與aerA基因同源性較高的這些h1yA序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測，發(fā)現(xiàn)它們均具有APT結(jié)構(gòu)域和氣溶素結(jié)構(gòu)域，說明它們實(shí)際上應(yīng)是aerA基因，只是命名上與h1yA基因混淆。用DNAstar軟件預(yù)測aerA和h1yA的抗原區(qū)，顯示它們均具有很好的抗原性。用

5、特異性引物檢測菌株的aerA基因和h1yA基因，結(jié)果顯示二株毒力株均有特異條帶，而無毒株則未擴(kuò)增到特異條帶，說明aerA和h1yA有可能作為鑒定嗜水氣單胞菌毒力菌株的標(biāo)記。
　　 3.重組外膜蛋白W的制備
　　 以Wp3菌株基因組DNA作為模板擴(kuò)增外膜蛋白W基因(OmpW)。OmpW基因全長為865bp，其中開放式閱讀框(ORF)為615bp，與標(biāo)準(zhǔn)株ATCC7966的OmpW基因的同源性高達(dá)99.8％。使用蛋白結(jié)構(gòu)分析

6、軟件對該ORF框編碼的蛋白高級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)其編碼的蛋白質(zhì)具有一個(gè)由8個(gè)β折疊組成的結(jié)構(gòu)域。根據(jù)ORF序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，將不含信號(hào)肽的OmpW基因編碼序列克隆到表達(dá)載體pQE30中，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌M15，經(jīng)誘導(dǎo)可表達(dá)分子量大小為24.7kDa的帶外膜蛋白與his標(biāo)簽的融合蛋白His-W。
　　 4.重組蛋白免疫原性與保護(hù)作用評價(jià)
　　 融合蛋白His-W經(jīng)過鎳柱純化后，對草魚進(jìn)行免疫實(shí)驗(yàn)。受免草魚血清經(jīng)Elisa