苦參堿治療高果糖飲食誘導(dǎo)大鼠非酒精性脂肪性肝病的分子機(jī)制研究.pdf

1、非酒精性脂肪性肝病(non-alcohol fatty liver disease，NAFLD)是指除外過量酒精和其他具有明確因素所致的，以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變?yōu)橹饕卣鞯呐R床病理綜合征。根據(jù)病理變化分為三個(gè)階段:單純性脂肪肝，非酒精性脂肪性肝炎(non alcoholic steatohepatitis，NASH)，脂肪性肝硬化（肝纖維化和肝硬化）。近幾十年來，NAFLD發(fā)病率迅猛增加，有研究表明大量攝入富含高果糖的軟飲料與NAF

2、LD的發(fā)生有密切關(guān)系。資料表明NAFLD呈進(jìn)展性，尤其在NASH階段，患者有20％-50％發(fā)展為進(jìn)展性肝纖維化，發(fā)展為肝硬化的風(fēng)險(xiǎn)為30％，5％會(huì)發(fā)展為肝癌。因此防治NAFLD已成為醫(yī)學(xué)和社會(huì)普遍關(guān)注的熱點(diǎn)問題。
　　 目前較為公認(rèn)的NAFLD發(fā)病機(jī)制是“二次打擊”學(xué)說:“初次打擊”為胰島素抵抗;“第二次打擊”以氧化應(yīng)激為核心，引起已經(jīng)脂肪變性的肝細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)生炎癥、壞死，呈進(jìn)展性肝纖維化。因此氧化應(yīng)激是NAFLD發(fā)展惡化的關(guān)鍵

3、。氧化應(yīng)激狀態(tài)下，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物生成增加，多種細(xì)胞因子釋放，如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，白介素-1等，介導(dǎo)炎性反應(yīng)，導(dǎo)致肝細(xì)胞發(fā)生炎癥、壞死，肝臟出現(xiàn)纖維化反應(yīng)。
　　 機(jī)體通過抗氧化防御機(jī)制抑制自由基的過量生成以及修復(fù)細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。機(jī)體抗氧化防御體系主要由抗氧化酶類系統(tǒng)構(gòu)成，包括:NAD(P)H醌氧化還原酶1(NAD(P)H: quinine oxidoreducta

4、se1，NQO1)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)以及血紅素加氧酶(haeme oxygenase1，HO-1)等。這些抗氧化應(yīng)激酶通過消除超氧陰離子自由基，維持晶體蛋白巰基的還原狀態(tài)，減輕機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)，提高細(xì)胞穩(wěn)定性，防止和糾正組織細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。此外，非酶類抗氧化物谷胱甘肽(g

5、lutathione，GSH)在抗氧化應(yīng)激方面也發(fā)揮重要作用。
　　 核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid2-related factor2，Nrf2)是近年來發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞抗氧化還原的中樞調(diào)節(jié)者，具有誘導(dǎo)編碼調(diào)控二相解毒酶基因和抗氧化酶基因的作用。在正常情況下，Nrf2位于胞漿中，與Keap1結(jié)合呈無活性狀態(tài)，在自由基及氧化應(yīng)激的刺激下，Nrf2與Keap1解離，轉(zhuǎn)入胞核內(nèi)，與抗氧化反應(yīng)元件(an

6、tioxidant responsive element, ARE)結(jié)合，通過ARE的轉(zhuǎn)錄激活下游抗氧化酶發(fā)揮抗氧化損傷和抗炎作用。有研究表明，Nrf2的缺失明顯加重了非酒精性脂肪肝的進(jìn)程。
　　 非酒精性脂肪性肝病屬中醫(yī)“脅痛”、“黃疸”等病范疇。多由過食肥甘厚味，濕熱蘊(yùn)藉中焦，濕熱阻滯，病理機(jī)制主要在“濕”、“熱”?？鄥A具有清熱、利濕功效，可從多個(gè)環(huán)節(jié)和途徑發(fā)揮抗肝損傷作用?？鄥A為中藥苦參提取物，現(xiàn)代藥理研究表明，苦參堿

7、具有抗炎、免疫抑制、抗纖維化作用，臨床廣泛用于慢性肝損傷患者，因此，本課題組認(rèn)為，苦參堿可能具有預(yù)防或逆轉(zhuǎn)NAFLD病程的作用，并對(duì)其抗NAFLD的分子機(jī)制進(jìn)行深入研究。
　　 本研究通過高果糖飲食誘導(dǎo)大鼠非酒精性脂肪性肝病病模型;苦參堿干預(yù)4周和8周，采用HE染色、全自動(dòng)生化分析、Western blot、RT-PCR、ELISA等實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)大鼠血脂、胰島素抵抗、肝臟轉(zhuǎn)氨酶、以及NQO1、HO-1、GPx、SOD、CAT、N

8、rf2、NF-κB等指標(biāo)的變化，探討苦參堿治療NAFLD的作用及其部分作用機(jī)制，為苦參堿治療NAFLD提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 第一部分高果糖飲食誘導(dǎo)大鼠非酒精性脂肪性肝病模型的建立與評(píng)價(jià)。
　　 目的:通過高果糖飲食喂養(yǎng)成功建立具有代謝綜合征背景的大鼠NAFLD模型，誘導(dǎo)大鼠胰島素抵抗、高甘油三酯血癥及肝組織脂質(zhì)的沉積。隨著高果糖喂養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，觀察肝臟組織病理的進(jìn)展及肝臟纖維化指標(biāo)羥脯氨酸(hydroxyproline，

9、HYP)、TGF-β和層粘連蛋白(laminin，LN)的變化。
　　 方法:清潔級(jí)雄性健康Wistar大鼠36只，體重180-200克，全部購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)(1104100)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在河北省人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，每籠2-3只，自由進(jìn)食、飲水，室溫(22±1)℃左右，相對(duì)濕度40％-60％，每日12小時(shí)光照維持，晝夜循環(huán)。大鼠隨機(jī)分為兩組:正常對(duì)照組(STD)和高果糖組(HFD)，每組18只。正常對(duì)照組

10、予以基礎(chǔ)飼料，熱量組成（碳水化合物65％，脂肪8％，蛋白質(zhì)21％，其他6％），總熱量為260kcal/100g;高果糖組予以高果糖飼料，即基礎(chǔ)飼料中碳水化合物部分的50％用食品級(jí)結(jié)晶果糖代替，熱量組成:碳水化合物65％（其中果糖含32.5％），其余與基礎(chǔ)飼料相同。于高果糖喂養(yǎng)后的第4周末、第8周末和第12周末，兩組按隨機(jī)原則分別選取6只大鼠，測(cè)血壓，然后禁食12小時(shí)過夜，用羅氏血糖儀采尾尖血測(cè)空腹血糖，稱體重后麻醉，腹主動(dòng)脈取血，然后迅

11、速取出肝臟組織，剪取部分肝組織切成組織塊迅速放-70℃液氮中保存。將凍存肝組織勻漿，檢測(cè)TG及HYP含量;應(yīng)用western blot和RT-PCR法檢測(cè)肝臟組織TGF-β和LN蛋白表達(dá)及基因表達(dá)，部分肝左葉組織固定于4％多聚甲醛溶液中固定、石蠟包埋、制成4μm厚切片，HE染色觀察肝臟病理組織學(xué)變化。收集的血標(biāo)本3000r/min離心10min，取上清，-70℃冰箱保存待測(cè)血生化指標(biāo)及瘦素、脂聯(lián)素水平。
　　 結(jié)果:
　　

12、 1、高果糖飲食誘導(dǎo)非酒精性脂肪性肝病模型大鼠的體重變化:與對(duì)照組比較，高果糖組大鼠在4周、8周體重明顯升高(P＜0.01），12周時(shí)高果糖組體重較對(duì)照組降低(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2、高果糖飲食誘導(dǎo)非酒精性脂肪性肝病模型大鼠的血壓變化:與對(duì)照組相比較，高果糖組大鼠在4周血壓較對(duì)照組上升，但差異未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05），8周和12周時(shí)血壓明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)。
　　 3、高果糖飲食

13、誘導(dǎo)非酒精性脂肪性肝病模型大鼠的血漿生化指標(biāo)的變化:與對(duì)照組比較，高果糖組大鼠血膽固醇和甘油三酯水平在4周、8周和12周時(shí)明顯高于對(duì)照組(P＜0.05，P＜0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;血漿ALT和AST水平在4周時(shí)兩組間無差異，高果糖組在8周和12周時(shí)ALT和AST水平高于對(duì)照組(P＜0.01，P＜0.05);空腹血糖在4周時(shí)兩組間無差異(P＞0.05），高果糖組在8周和12周時(shí)空腹血糖高于對(duì)照組(P＜0.01）;空腹胰島素及HOMA

14、-IR在4周、8周和12周時(shí)明顯高于對(duì)照組(P＜0.01）。
　　 4、非酒精性脂肪性肝病模型大鼠的血漿瘦素、脂聯(lián)素水平的變化:血漿瘦素水平4周較對(duì)照組升高(P＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;8周和12周時(shí)升高更加明顯（P＜0.01）;血漿脂聯(lián)素水平在4周、8周和12周時(shí)明顯低于對(duì)照組(P＜0.01）。
　　 5、非酒精性脂肪性肝病模型大鼠肝組織TG含量變化:與對(duì)照組比較，高果糖組大鼠肝組織的TG含量在4周、8周時(shí)和12

15、周時(shí)明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;8周比4周升高略有增加(P＞0.05），12周較8周下降(P＜0.05)。
　　 6、非酒精性脂肪性肝病模型大鼠肝組織HYP含量:大鼠血漿HYP含量在高果糖喂養(yǎng)8周和12周時(shí)與正常對(duì)照組相比升高(P＜0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 7、非酒精性脂肪性肝病模型大鼠肝組織TGF-β和LN的蛋白和mRNA表達(dá):與對(duì)照組比較，高果糖喂養(yǎng)8周和12周時(shí)，T

16、GF-β蛋白表達(dá)明顯升高(P＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;肝組織LN蛋白水平與TGF-β變化趨勢(shì)相同。
　　 高果糖喂養(yǎng)8周時(shí)，TGF-β mRNA表達(dá)和正常對(duì)照組相比升高(P＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，12周時(shí)TGF-β mRNA表達(dá)升高更加明顯;肝組織LN mRNA表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)與TGF-β mRNA表達(dá)變化趨勢(shì)相同。
　　 8、肝臟HE染色觀察脂肪肝程度:光鏡下觀察肝臟，高果糖模型大鼠成模率達(dá)到100％，高果

17、糖組大鼠在4周時(shí)肝組織切片可見肝細(xì)胞內(nèi)脂滴沉積，形成單純性脂肪肝;8周時(shí)肝細(xì)胞內(nèi)脂滴沉積明顯增加，可見肝細(xì)胞呈氣球樣變，同時(shí)可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及灶性壞死形成NASH;12周時(shí)肝細(xì)胞炎性細(xì)胞大量浸潤(rùn)，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，大量壞死組織形成，纖維組織增生。
　　 結(jié)論:
　　 1、高果糖飲食喂養(yǎng)可導(dǎo)致大鼠呈現(xiàn)代謝綜合征的表現(xiàn)，出現(xiàn)了體重增加，血壓升高，胰島素抵抗和糖代謝異常，以及高血脂。隨時(shí)間延長(zhǎng)，上述變化更加顯著。
　　

18、2、高果糖飲食喂養(yǎng)可引起大鼠血漿瘦素水平升高，脂聯(lián)素水平降低，而高瘦素血癥和低脂聯(lián)素血癥是非酒精性脂肪肝的危險(xiǎn)因素。
　　 3、高果糖飲食喂養(yǎng)4周成功建立NAFLD大鼠模型，大鼠肝臟甘油三酯蓄積，隨時(shí)間延長(zhǎng)，其水平增加;隨著脂肪沉積的加重，肝臟轉(zhuǎn)氨酶水平逐漸升高，肝臟功能受損，且肝臟纖維化指標(biāo)逐漸升高，病理表現(xiàn)逐漸加重，可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、壞死組織，形成NASH。
　　 第二部分苦參堿對(duì)高果糖飲食誘導(dǎo)的大鼠非酒精性脂肪性肝

19、病的治療作用。
　　 目的:通過觀察苦參堿治療后，高果糖喂養(yǎng)大鼠肝臟組織病理學(xué)改善，肝組織TGF-β和LN mRNA表達(dá)以及蛋白表達(dá)的變化，肝臟TG含量、血漿生化指標(biāo)的改變及其他代謝組分的變化，明確苦參堿對(duì)NAFLD的保護(hù)作用。
　　 方法:雄性健康Wistar大鼠72只，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的管理同第一部分。分組:大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為兩組:正常對(duì)照組（STD，18只）和高果糖模型組(HFD，54只)，分別予以基礎(chǔ)飼料及高果

20、糖飼料（組成同第一部分）。喂養(yǎng)4周后，兩組分別隨機(jī)抽取6只大鼠，麻醉后處死，留取肝組織HE染色，證實(shí)非酒精性脂肪性肝病動(dòng)物模型成功建立。然后將高果糖喂養(yǎng)大鼠隨機(jī)分為四組，分別為高果糖模型組（高果糖喂養(yǎng)，無苦參堿干預(yù)，HFD），低劑量組（高果糖喂養(yǎng)+苦參堿40mg/kg，L-MA），中劑量組（高果糖喂養(yǎng)+苦參堿80mg/kg，M-MAT），高劑量(高果糖喂養(yǎng)+苦參堿160mg/kg，H-MAT)。各組于苦參堿干預(yù)后的第4周末和第8周末按隨

21、機(jī)原則抽取大鼠各6只，麻醉后處死，標(biāo)本留取及指標(biāo)檢測(cè)方法同第一部分。
　　 結(jié)果:
　　 1、苦參堿治療后非酒精性脂肪性肝病模型大鼠體重的變化:與高果糖組比較，不同劑量苦參堿組對(duì)大鼠體重沒有影響(P＞0.05），說明苦參堿的治療作用不是通過減體重作用而產(chǎn)生。
　　 2、苦參堿治療后非酒精性脂肪性肝病模型大鼠血壓的變化:不同劑量的苦參堿作用于非酒精性脂肪性肝病模型大鼠4周、8周后，與高果糖組比較，相同時(shí)間點(diǎn)的不同劑

22、量苦參堿均能使大鼠升高的血壓下降（低劑量P＜0.05;中、高劑量P＜0.01），中高劑量組與低劑量組相比有顯著性差異(P＜0.05）;中、高劑量組之間無顯著性差異(P＞0.05);
　　 3、高果糖飲食誘導(dǎo)非酒精性脂肪性肝病模型大鼠的血漿生化指標(biāo)的變化:不同劑量的苦參堿作用于非酒精性脂肪性肝病模型大鼠4周后，與高果糖組比較，相同時(shí)間點(diǎn)的不同劑量苦參堿均能使高果糖誘導(dǎo)的大鼠升高的甘油三酯下降，低劑量組即可比高果糖組下降(P＜0.0

23、5），中高劑量組比高果糖組下降更為明顯(P＜0.01)，低劑量組與中高劑量組之間有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01);中、高劑量組之間無顯著性差異(P＞0.05); ALT和AST水平變化趨勢(shì)與上述變化相同，在空腹胰島素水平及HOMA-IR也能觀察到相同的變化趨勢(shì)。中劑量組苦參堿治療4周時(shí)與高果糖組相比TC下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）。治療8周后，各劑量治療組生化指標(biāo)與高果糖組相比均有明顯差異，除AST外，各指標(biāo)在低劑量

24、組即可有顯著性差異(P＜0.01），中、高劑量組和高果糖組相比下降更為明顯(P＜0.01);而AST在各劑量治療組和高果糖組相比下降（P＜0.05）。
　　 4、非酒精性脂肪性肝病模型大鼠的血漿瘦素、脂聯(lián)素水平的變化:血漿瘦素在高果糖組較正常對(duì)照明顯升高(P＜0.01);不同劑量的苦參堿作用于非酒精性脂肪性肝病模型大鼠4周后，瘦素水平下降（P＜0.01），低劑量組與中高劑量組之間有顯著性差異（P＜0.05）;中、高劑量組之間無顯

25、著性差異(P＞0.05）;治療8周瘦素水平比相同時(shí)間點(diǎn)高果糖組下降(P＜0.01），各治療組間無差異。血漿脂聯(lián)素水平于苦參堿治療后，4周時(shí)較高果糖組明顯升高(P＜0.05）;治療8周，脂聯(lián)素水平與相同時(shí)間點(diǎn)高果糖組相比升高（P＜0.01），低劑量組與中高劑量組之間無差異（P＞0.05）。
　　 5、非酒精性脂肪性肝病模型大鼠肝組織TG含量變化:肝組織的TG含量在高果糖組較正常對(duì)照明顯升高(P＜0.01);苦參堿作用于非酒精性脂肪

26、性肝病模型大鼠4周后，肝臟TG含量呈劑量依賴性下降(P＜0.01），H-MAT比L-MAT下降更明顯(P＜0.05）;治療8周肝臟TG含量比相同時(shí)間點(diǎn)高果糖組下降(P＜0.01），低劑量組與中高劑量組之間有顯著性差異(P＜0.01);中、高劑量組之間無顯著性差異(P＞0.05）。
　　 6、非酒精性脂肪性肝病模型大鼠肝組織HYP含量:肝組織的HYP含量在高果糖組較正常對(duì)照明顯升高(P＜0.01），苦參堿干預(yù)4周，大鼠肝組織HYP

27、含量與高果糖組比較有明顯下降(P＜0.05，P＜0.01);苦參堿干預(yù)8周，HYP含量與同時(shí)間點(diǎn)高果糖組比較有明顯下降(P＜0.01)。
　　 7、非酒精性脂肪性肝病模型大鼠肝組織TGF-β和LN的蛋白表達(dá):肝組織TGF-β的蛋白表達(dá)在高果糖組較正常對(duì)照明顯升高(P＜0.01)，苦參堿干預(yù)4周，大鼠肝組織TGF-β蛋白表達(dá)在低劑量組與高果糖組比較無差異(P＞0.05），中劑量組和高劑量組與高果糖組比較有差異(P＜0.01）;苦參

28、堿干預(yù)8周，大鼠肝組織TGF-β蛋白表達(dá)在低劑量組與高果糖組比較無差異(P＞0.05），中劑量組和高劑量組與高果糖組比較有差異(P＜0.01，P＜0.05)。LN的蛋白表達(dá):肝組織LN的蛋白表達(dá)在高果糖組較正常對(duì)照明顯升高(P＜0.01)，苦參堿治療4周時(shí)，各治療組與高果糖組相比明顯下降(P＜0.01)，M-MAT組LN表達(dá)與L-MAT及H-MAT組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。治療8周后各治療組與相同時(shí)間點(diǎn)的高果糖組相比具有和治療

29、4周相同的變化趨勢(shì)。
　　 8、非酒精性脂肪性肝病模型大鼠肝組織TGF-β和LN的mRNA表達(dá):肝組織TGF-β mRNA表達(dá)在高果糖組較正常對(duì)照明顯升高(P＜0.01），與高果糖組比較，苦參堿干預(yù)4周和8周，大鼠肝組織TGF-β mRNA表達(dá)與相同時(shí)間點(diǎn)高果糖組相比均呈劑量依賴性降低;肝組織LN mRNA表達(dá)呈相同的變化趨勢(shì)。
　　 9、肝臟HE染色觀察脂肪肝程度:光鏡下觀察大鼠肝臟HE染色，高果糖組大鼠肝組織切片8周

30、時(shí)（苦參堿治療4周），肝細(xì)胞內(nèi)脂滴沉積明顯增加，可見肝細(xì)胞呈氣球樣變，同時(shí)可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn);苦參堿低劑量治療組脂質(zhì)沉積明顯減輕，但仍可見灶性壞死，中劑量組可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及脂質(zhì)沉積均明顯減輕，高劑量組改善更加明顯。高果糖組大鼠肝HE切片12周時(shí)（苦參堿治療8周），肝細(xì)胞呈氣球樣變，炎性細(xì)胞大量浸潤(rùn)，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，大量壞死組織形成，纖維組織增生;苦參堿呈劑量依賴性減輕肝細(xì)胞壞死，減少炎細(xì)胞浸潤(rùn)和脂質(zhì)沉積。
　　 結(jié)論:
　

31、　 1、苦參堿治療非酒精性脂肪性肝病大鼠，對(duì)體重沒有影響，說明苦參堿的治療作用不是通過減體重作用而產(chǎn)生。
　　 2、苦參堿可改變高果糖飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝病大鼠的血壓、血脂和血漿胰島素水平，改善高瘦素血癥和提高血漿脂聯(lián)素水平。
　　 3、苦參堿干預(yù)可改善高果糖誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝病肝臟轉(zhuǎn)氨酶水平、減少肝臟甘油三酯沉積，在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平降低肝組織纖維化指標(biāo)的表達(dá)。
　　 4、苦參堿在組織病理學(xué)上減少高果糖

32、引起的大鼠肝細(xì)胞內(nèi)脂滴沉積，減少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，減輕灶性壞死及纖維組織增生。
　　 第三部分苦參堿對(duì)高果糖飲食誘導(dǎo)的大鼠非酒精性脂肪性肝病氧化應(yīng)激的影響。
　　 目的:通過觀察高果糖喂養(yǎng)大鼠肝組織中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛的含量變化，非酶抗氧化物谷胱甘肽和抗氧化酶過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)活性， CAT、SOD、NAD(P)H醌氧化還原酶1(NQO1)、血紅素加氧酶1(HO-1

33、)蛋白表達(dá)，探討氧化應(yīng)激在高果糖導(dǎo)致NAFLD進(jìn)展中的作用。通過苦參堿干預(yù)后上述指標(biāo)的變化，探討其肝保護(hù)作用機(jī)制。
　　 方法:動(dòng)物分組及肝組織標(biāo)本取得同第二部分。肝組織MDA、GSH含量和CAT、SOD、GPx活性檢測(cè)均嚴(yán)格按試劑盒說明書操作，應(yīng)用western blot方法分析CAT、SOD、NQO1和HO-1在肝組織蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1、苦參堿治療的非酒精性脂肪性肝病大鼠肝臟MDA含量的變化:

34、肝臟MDA含量在高果糖組比正常對(duì)照組明顯升高(P＜0.01);與高果糖組比較，苦參堿干預(yù)4周，肝組織MDA含量呈劑量依賴性降低(P＜0.01)，低劑量組與中高劑量組比有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01);治療8周時(shí)，各治療組與高果糖組比較均明顯降低(P＜0.01），各治療組之間無差異(P＞0.05）。
　　 2、苦參堿治療的非酒精性脂肪性肝病大鼠肝臟GSH含量的變化:肝臟GSH含量在高果糖組比正常對(duì)照組明顯降低(P＜0.0

35、1）;不同劑量的苦參堿作用于非酒精性脂肪性肝病模型大鼠4周、8周后GSH含量比相同時(shí)間點(diǎn)高果糖組升高(P＜0.01）。4周時(shí)，低劑量組與中高劑量組之間有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01);中、高劑量組之間無顯著性差異(P＞0.05）。8周時(shí)，各治療組之間無顯著性差異(P＞0.05）。
　　 3、苦參堿治療的非酒精性脂肪性肝病大鼠肝組織CAT活性的變化:肝臟CAT活性在高果糖組比正常對(duì)照組明顯降低(P＜0.01);40mg苦

36、參堿作用于非酒精性脂肪性肝病模型大鼠4周CAT活性比相同時(shí)間點(diǎn)高果糖組增加87.7％(P＜0.01）;各劑量組之間無顯著性差異(P＞0.05)?？鄥A治療8周，與高果糖組相比，低劑量治療組肝臟內(nèi)CAT活性增加187％(P＜0.01)，各劑量組之間無顯著性差異(P＞0.05）。
　　 4、苦參堿治療的非酒精性脂肪性肝病大鼠肝組織SOD活性的變化:肝臟SOD活性在高果糖組比正常對(duì)照組明顯降低(P＜0.01);40mg苦參堿作用于非酒

37、精性脂肪性肝病模型大鼠4周SOD活性比相同時(shí)間點(diǎn)高果糖組增加96.9％(P＜0.01）;各劑量組之間無顯著性差異（P＞0.05）?？鄥A治療8周，與高果糖組相比，低劑量治療組肝臟內(nèi)SOD活性增加193％(P＜0.01)，各劑量組之間無顯著性差異(P＞0.05）。
　　 5、苦參堿治療的非酒精性脂肪性肝病大鼠肝組織GPx活性的變化:肝臟GPx活性在高果糖組比正常對(duì)照組明顯降低(P＜0.01);40mg苦參堿作用于非酒精性脂肪性肝模

38、型大鼠4周GPx活性比相同時(shí)間點(diǎn)高果糖組增加51.7％(P＜0.01)，中高劑量組增加更為明顯，與低劑量組相比有差異(P＜0.05，P＜0.01);苦參堿治療8周，與高果糖組相比，低劑量治療組肝臟內(nèi)GPx活性增加78.7％(P＜0.01)，各劑量組之間無顯著性差異(P＞0.05）。
　　 6、苦參堿治療的非酒精性脂肪性肝病大鼠肝組織抗氧化酶蛋白表達(dá)(CAT、SOD、HO-1、NQO1)的變化:肝臟CAT、SOD、HO-1、NQO

39、1蛋白表達(dá)在高果糖組比正常對(duì)照組升高(P＜0.01）;不同劑量的苦參堿作用于非酒精性脂肪性肝病模型大鼠4周后，上述各指標(biāo)蛋白表達(dá)比相同時(shí)間點(diǎn)高果糖組進(jìn)一步升高(P＜0.01)，低劑量組與中高劑量組之間有顯著性差異(P＜0.01)。
　　 不同劑量的苦參堿作用于非酒精性脂肪性肝病模型大鼠8周后，上述各指標(biāo)蛋白表達(dá)呈現(xiàn)不均一性。CAT和SOD的中高劑量組比低劑量組作用更強(qiáng)（P＜0.01），中、高劑量組之間無顯著性差異(P＞0.05)

40、; HO-1的低、中劑量組之間無顯著性差異（P＞0.05），高劑量組比中、低劑量組作用更強(qiáng)(P＜0.05); NQO1各劑量組之間無顯著性差異。
　　 結(jié)論:
　　 1、高果糖飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝病大鼠肝臟MDA明顯增加，提示肝內(nèi)脂質(zhì)過氧化的增強(qiáng)，肝內(nèi)氧化應(yīng)激的增加;苦參堿干預(yù)后肝內(nèi)MDA含量明顯下降，提示苦參堿能夠改善脂質(zhì)過氧化。
　　 2、高果糖飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝病大鼠肝臟GSH含量明顯下降，且

41、隨著喂養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，降低更加明顯，提示肝內(nèi)非酶抗氧化能力的下降;苦參堿干預(yù)后肝內(nèi)GSH含量明顯增加，提示苦參堿能夠改善肝內(nèi)非酶抗氧化能力。
　　 3、高果糖飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝病大鼠肝臟CAT、SOD和GPx活性明顯下降，且隨著喂養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，降低更加明顯，提示肝內(nèi)酶類抗氧化能力的下降;苦參堿干預(yù)后肝內(nèi)CAT、SOD和GPx活性增加，提示苦參堿能夠改善肝內(nèi)酶類抗氧化能力。
　　 4、高果糖飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝

42、病大鼠肝臟CAT、SOD、HO-1和NQO1蛋白表達(dá)水平增加，提示機(jī)體對(duì)于氧化應(yīng)激存在適應(yīng)性調(diào)節(jié);苦參堿干預(yù)后進(jìn)一步增加上述抗氧化酶蛋白表達(dá)，提示苦參堿能夠在翻譯水平提高肝臟抗氧化能力。
　　 第四部分苦參堿對(duì)高果糖飲食誘導(dǎo)的大鼠非酒精性脂肪性肝病Nrf2抗氧化應(yīng)激通路的影響。
　　 目的:通過觀察高果糖喂養(yǎng)大鼠肝組織中核因子NF-E2相關(guān)因子(Nrf2)、NF-κB及血漿腫瘤壞死因子α(TNF-α)的變化，探討Nrf2

43、在高果糖喂養(yǎng)致大鼠NAFLD中的作用，并觀察苦參堿干預(yù)后上述指標(biāo)的變化，探討Nrf2在苦參堿肝保護(hù)中的作用。
　　 方法:動(dòng)物模型的建立、分組及肝組織標(biāo)本取得與第二部分相同。分別制備肝細(xì)胞總蛋白和核蛋白。應(yīng)用Western blot法分析肝細(xì)胞總Nrf2和核內(nèi)Nrf2、肝細(xì)胞總NF-κB和核內(nèi)NF-κB的蛋白表達(dá)，檢測(cè)血漿TNF-α水平。
　　 結(jié)果:
　　 1、苦參堿對(duì)非酒精性脂肪性肝病大鼠肝臟Nrf2蛋白表達(dá)

44、的作用:肝臟總Nrf2蛋白表達(dá)在對(duì)照組、高果糖組和不同劑量治療組間無差異(P＞0.05）。肝臟核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)在高果糖組較對(duì)照組升高(P＜0.01），不同劑量的苦參堿作用于非酒精性脂肪性肝病模型大鼠4周和8周后，核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)比相同時(shí)間點(diǎn)高果糖組進(jìn)一步升高(P＜0.01)，低劑量組與中高劑量組之間有顯著性差異(P＜0.01);中、高劑量組之間無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 2、苦參堿對(duì)非酒精性脂肪性肝病大鼠肝臟N

45、F-κB蛋白表達(dá)的作用:肝臟總NF-κB蛋白表達(dá)在對(duì)照組、高果糖組和不同劑量治療組間無差異(P＞0.05）。肝臟核內(nèi)NF-κB蛋白表達(dá)在高果糖組較對(duì)照組明顯升高(P＜0.01），不同劑量的苦參堿作用于非酒精性脂肪性肝病模型大鼠4周和8周后，核內(nèi)NF-κB蛋白表達(dá)比相同時(shí)間點(diǎn)高果糖組明顯降低(P＜0.01)，低劑量組與中高劑量組之間有顯著性差異(P＜0.01）;中、高劑量組之間無顯著性差異(P＞0.05）。
　　 3、苦參堿對(duì)非酒

46、精性脂肪性肝病大鼠血漿TNF-α水平的作用:高果糖組血漿TNF-α水平較對(duì)照組明顯升高(P＜0.01)，不同劑量的苦參堿作用于非酒精性脂肪性肝病模型大鼠4周、8周后血漿TNF-α水平比相同時(shí)間點(diǎn)高果糖組明顯降低(P＜0.01），各劑量組之間無顯著性差異(P＞0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 1、高果糖誘導(dǎo)的NAFLD大鼠肝細(xì)胞核內(nèi)Nrf2較對(duì)照組增加，提示機(jī)體對(duì)長(zhǎng)期高果糖喂養(yǎng)氧化應(yīng)激的慢性適應(yīng)性調(diào)節(jié);不同劑量的苦參堿作用