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1、目的:本研究基于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)“腸-肝軸”學(xué)說(shuō)和中醫(yī)“肝脾相關(guān)”理論,在前期臨床研究和實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上,探討具有健脾化濁功效的消脂益肝方對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的模型大鼠非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)的防治作用,從該方對(duì)“代謝性炎癥”與腸道粘膜微生態(tài)屏障的影響角度探討其從脾論治NAFLD的作用機(jī)制。
方法:1.理論部分:回顧了近年來(lái)腸道微生態(tài)環(huán)境紊亂與NAFLD的相關(guān)研究進(jìn)展
2、,深入分析了中醫(yī)脾和腸道微生態(tài)之間的相關(guān)性,并結(jié)合導(dǎo)師從脾論治慢性肝病的學(xué)術(shù)思想,從病因病機(jī)角度總結(jié)、提出了“從脾論治”防治 NAFLD的思路。2.實(shí)驗(yàn)部分:無(wú)特定病原體級(jí)(Specific pathogen free,SPF)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠40只,隨機(jī)分為4組,其中空白對(duì)照組、中藥干預(yù)組(消脂益肝方組)、益生菌干預(yù)組每組各8只,模型對(duì)照組16只。空白對(duì)照組以標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng),其余3組大鼠均采用高脂飼料飼養(yǎng),模
3、型對(duì)照組每4周隨機(jī)選取2只大鼠處死以動(dòng)態(tài)評(píng)估模型的復(fù)制情況,實(shí)驗(yàn)歷時(shí)16周復(fù)制出NAFLD模型。于造模第5周,中藥組以消脂益肝方12.5g·kg-1d-1的劑量灌胃給藥,益生菌組給予雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片(商品名:金雙歧)0.7g·kg-1d-1的劑量灌胃給藥,空白對(duì)照組和模型對(duì)照組予以等體積的0.9%氯化鈉溶液灌胃,每周測(cè)量1次體重,根據(jù)體重變化調(diào)整灌胃劑量,共給藥干預(yù)12周。于末次給藥24h后處死全部大鼠,采集血液和肝臟、回腸組織
4、及粘液、收集結(jié)腸內(nèi)糞便樣本。
采用生化分析法檢測(cè)血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)?天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)的水平和肝臟組織勻漿中甘油三脂(triglyceride, TG)、游離脂肪酸(free fatty acid,FFA)的含量。采用蘇木精伊紅染色法(hematoxylin eosin staining,HE)判定
5、肝組織 NAFLD活動(dòng)度積分(NAFLD activity score,NAS);采用油紅O染色觀察肝臟脂質(zhì)沉積情況;采用Masson染色觀察大鼠肝臟肝纖維化的情況。分別通過(guò)光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡對(duì)各組大鼠回腸粘膜組織進(jìn)行普通病理學(xué)和超微病理學(xué)觀察。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)大鼠血清中 TNF-α(Tumor necrosis factor-α)、IL-1β
6、(Inteleukin-1β)水平。采用鱟試劑顯色基質(zhì)法測(cè)定大鼠門靜脈血漿脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)的含量。采用 Western blot(免疫印跡試驗(yàn))法檢測(cè)大鼠回腸組織中 TLR4、NF-κBp65蛋白的表達(dá)。采用Real-TimePCR(SYBR Green)絕對(duì)定量法檢測(cè)分析結(jié)腸糞便中4種目標(biāo)菌群的含量。免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)大鼠回腸組織中Occludin、ZO-1蛋白的表達(dá)。采用ELISA法測(cè)定腸道
7、粘液中SIgA的含量。
結(jié)果:
1.各組動(dòng)物體重和肝指數(shù)的比較。試驗(yàn)第16周,與空白對(duì)照組比較,模型對(duì)照組大鼠體重和肝指數(shù)顯著升高。而經(jīng)消脂益肝方干預(yù)后,大鼠體重和肝指數(shù)均顯著下降。
2.各組大鼠血清、肝臟勻漿生化指標(biāo)的比較。與空白對(duì)照組比較,模型對(duì)照組大鼠血清AST? ALT的水平顯著升高,而以AST升高更為顯著;肝臟勻漿組織中 TG、FFA的含量亦升高。而經(jīng)消脂益肝方和益生菌干預(yù)后,大鼠血清中AST?
8、ALT和肝臟勻漿中TG、FFA的水平均顯著下降。
3.各組大鼠肝臟病理形態(tài)學(xué)改變。與空白對(duì)照組比較,模型對(duì)照組大鼠肝臟NAS積分顯著升高,而經(jīng)消脂益肝方干預(yù)后,NAS積分顯著下降。油紅 O染色顯示模型對(duì)照組肝組織中紅色脂滴顯著增多,融合成片狀;消脂益肝方干預(yù)組大鼠肝細(xì)胞脂滴數(shù)量明顯減少,較稀疏。肝組織Masson染色顯示模型對(duì)照組膠原纖維染色明顯增多,部分標(biāo)本有纖維間隔形成;而消脂益肝方干預(yù)組膠原纖維組織著色明顯減少。
9、 4.消脂益肝方對(duì)NAFLD模型大鼠代謝性炎癥指標(biāo)的影響。與空白對(duì)照組比較,模型對(duì)照組大鼠門靜脈血漿LPS含量和血清IL-1β、TNF-α水平顯著升高;而消脂益肝方干預(yù)可明顯降低血漿 LPS含量和血清 IL-1β、TNF-α的水平顯著下降。
5.消脂益肝方對(duì)NAFLD模型大鼠腸粘膜微生態(tài)屏障的影響。試驗(yàn)主要從腸粘膜生物屏障、機(jī)械屏障、免疫屏障3個(gè)角度研究。結(jié)果顯示:(1)與空白對(duì)照組比較,模型對(duì)照組大鼠糞便樣本中大腸桿菌和陰
10、溝腸桿菌的數(shù)量增高,而雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量呈下降趨勢(shì);經(jīng)消脂益肝方干預(yù)后大鼠腸道中大腸桿菌和陰溝腸桿菌數(shù)量呈下降趨勢(shì),而雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量呈上升趨勢(shì)。(2)與空白對(duì)照組比較,Occludin、ZO-1蛋白的表達(dá)在模型對(duì)照組大鼠腸粘膜顯著下調(diào);經(jīng)消脂益肝方干預(yù)后Occludin、ZO-1蛋白的表達(dá)有所上調(diào)。此外,通過(guò)透射電鏡觀察到模型對(duì)照組大鼠回腸緊密連接縮短,橋粒結(jié)構(gòu)疏松,線粒體水腫、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張,經(jīng)脂益肝方干預(yù)后大鼠回腸緊密連接的
11、形態(tài)和完整性均得到一定的改善。(3)與空白對(duì)照組比較,模型對(duì)照組大鼠回腸TLR4、NF-κBp65蛋白表達(dá)顯著上調(diào);經(jīng)消脂益肝方干預(yù)后,而TLR4、NF-κBp65的表達(dá)水平呈下調(diào)趨勢(shì)。與空白對(duì)照組比較,模型對(duì)照組大鼠腸道粘液中SIgA的含量顯著下降,經(jīng)消脂益肝方干預(yù)組大鼠腸道粘液中SIgA的含量升高。
結(jié)論:基于“從脾論治”立法的消脂益肝方在保肝降酶(AST、ALT),改善肝臟脂質(zhì)代謝(TG、FFA)方面具有良好作用。同時(shí),
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