消脂益肝方防治高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠非酒精性脂肪性肝病的機(jī)制研究.pdf

1、目的：本研究基于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)“腸-肝軸”學(xué)說(shuō)和中醫(yī)“肝脾相關(guān)”理論，在前期臨床研究和實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，探討具有健脾化濁功效的消脂益肝方對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的模型大鼠非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)的防治作用，從該方對(duì)“代謝性炎癥”與腸道粘膜微生態(tài)屏障的影響角度探討其從脾論治NAFLD的作用機(jī)制。
　　方法：1.理論部分：回顧了近年來(lái)腸道微生態(tài)環(huán)境紊亂與NAFLD的相關(guān)研究進(jìn)展

2、，深入分析了中醫(yī)脾和腸道微生態(tài)之間的相關(guān)性，并結(jié)合導(dǎo)師從脾論治慢性肝病的學(xué)術(shù)思想，從病因病機(jī)角度總結(jié)、提出了“從脾論治”防治 NAFLD的思路。2.實(shí)驗(yàn)部分：無(wú)特定病原體級(jí)(Specific pathogen free，SPF)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠40只，隨機(jī)分為4組，其中空白對(duì)照組、中藥干預(yù)組（消脂益肝方組）、益生菌干預(yù)組每組各8只，模型對(duì)照組16只。空白對(duì)照組以標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)，其余3組大鼠均采用高脂飼料飼養(yǎng)，模

3、型對(duì)照組每4周隨機(jī)選取2只大鼠處死以動(dòng)態(tài)評(píng)估模型的復(fù)制情況，實(shí)驗(yàn)歷時(shí)16周復(fù)制出NAFLD模型。于造模第5周，中藥組以消脂益肝方12.5g·kg-1d-1的劑量灌胃給藥，益生菌組給予雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片（商品名：金雙歧）0.7g·kg-1d-1的劑量灌胃給藥，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組予以等體積的0.9％氯化鈉溶液灌胃，每周測(cè)量1次體重，根據(jù)體重變化調(diào)整灌胃劑量，共給藥干預(yù)12周。于末次給藥24h后處死全部大鼠，采集血液和肝臟、回腸組織

4、及粘液、收集結(jié)腸內(nèi)糞便樣本。
　　采用生化分析法檢測(cè)血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)?天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)的水平和肝臟組織勻漿中甘油三脂(triglyceride， TG)、游離脂肪酸(free fatty acid,FFA)的含量。采用蘇木精伊紅染色法(hematoxylin eosin staining,HE)判定

5、肝組織 NAFLD活動(dòng)度積分(NAFLD activity score,NAS);采用油紅O染色觀察肝臟脂質(zhì)沉積情況；采用Masson染色觀察大鼠肝臟肝纖維化的情況。分別通過(guò)光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡對(duì)各組大鼠回腸粘膜組織進(jìn)行普通病理學(xué)和超微病理學(xué)觀察。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)大鼠血清中 TNF-α(Tumor necrosis factor-α)、IL-1β

6、(Inteleukin-1β)水平。采用鱟試劑顯色基質(zhì)法測(cè)定大鼠門靜脈血漿脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）的含量。采用 Western blot(免疫印跡試驗(yàn))法檢測(cè)大鼠回腸組織中 TLR4、NF-κBp65蛋白的表達(dá)。采用Real-TimePCR(SYBR Green)絕對(duì)定量法檢測(cè)分析結(jié)腸糞便中4種目標(biāo)菌群的含量。免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)大鼠回腸組織中Occludin、ZO-1蛋白的表達(dá)。采用ELISA法測(cè)定腸道

7、粘液中SIgA的含量。
　　結(jié)果:
　　1．各組動(dòng)物體重和肝指數(shù)的比較。試驗(yàn)第16周，與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠體重和肝指數(shù)顯著升高。而經(jīng)消脂益肝方干預(yù)后，大鼠體重和肝指數(shù)均顯著下降。
　　2．各組大鼠血清、肝臟勻漿生化指標(biāo)的比較。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠血清AST? ALT的水平顯著升高，而以AST升高更為顯著；肝臟勻漿組織中 TG、FFA的含量亦升高。而經(jīng)消脂益肝方和益生菌干預(yù)后，大鼠血清中AST?

8、ALT和肝臟勻漿中TG、FFA的水平均顯著下降。
　　3．各組大鼠肝臟病理形態(tài)學(xué)改變。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠肝臟NAS積分顯著升高，而經(jīng)消脂益肝方干預(yù)后，NAS積分顯著下降。油紅 O染色顯示模型對(duì)照組肝組織中紅色脂滴顯著增多，融合成片狀；消脂益肝方干預(yù)組大鼠肝細(xì)胞脂滴數(shù)量明顯減少，較稀疏。肝組織Masson染色顯示模型對(duì)照組膠原纖維染色明顯增多，部分標(biāo)本有纖維間隔形成；而消脂益肝方干預(yù)組膠原纖維組織著色明顯減少。

9、　　4．消脂益肝方對(duì)NAFLD模型大鼠代謝性炎癥指標(biāo)的影響。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠門靜脈血漿LPS含量和血清IL-1β、TNF-α水平顯著升高；而消脂益肝方干預(yù)可明顯降低血漿 LPS含量和血清 IL-1β、TNF-α的水平顯著下降。
　　5．消脂益肝方對(duì)NAFLD模型大鼠腸粘膜微生態(tài)屏障的影響。試驗(yàn)主要從腸粘膜生物屏障、機(jī)械屏障、免疫屏障3個(gè)角度研究。結(jié)果顯示：（1）與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠糞便樣本中大腸桿菌和陰

10、溝腸桿菌的數(shù)量增高，而雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量呈下降趨勢(shì)；經(jīng)消脂益肝方干預(yù)后大鼠腸道中大腸桿菌和陰溝腸桿菌數(shù)量呈下降趨勢(shì)，而雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量呈上升趨勢(shì)。（2）與空白對(duì)照組比較，Occludin、ZO-1蛋白的表達(dá)在模型對(duì)照組大鼠腸粘膜顯著下調(diào)；經(jīng)消脂益肝方干預(yù)后Occludin、ZO-1蛋白的表達(dá)有所上調(diào)。此外，通過(guò)透射電鏡觀察到模型對(duì)照組大鼠回腸緊密連接縮短，橋粒結(jié)構(gòu)疏松，線粒體水腫、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，經(jīng)脂益肝方干預(yù)后大鼠回腸緊密連接的

11、形態(tài)和完整性均得到一定的改善。（3）與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠回腸TLR4、NF-κBp65蛋白表達(dá)顯著上調(diào)；經(jīng)消脂益肝方干預(yù)后，而TLR4、NF-κBp65的表達(dá)水平呈下調(diào)趨勢(shì)。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠腸道粘液中SIgA的含量顯著下降，經(jīng)消脂益肝方干預(yù)組大鼠腸道粘液中SIgA的含量升高。
　　結(jié)論：基于“從脾論治”立法的消脂益肝方在保肝降酶（AST、ALT），改善肝臟脂質(zhì)代謝（TG、FFA）方面具有良好作用。同時(shí)，