耐FQs大腸桿菌敏感性恢復差異及機制研究.pdf

1、在不同條件下對耐藥大腸桿菌進行傳代培養(yǎng)，考察耐藥菌對不同氟喹諾酮類藥物（FQs）敏感性恢復中的差異，以及 Plassmid-mediated quinolone resistance（PMQR）耐藥基因和 gyrA基因在傳代前后是否發(fā)生變化。分析適合度代價對耐藥大腸桿菌敏感性恢復的影響，以研究耐氟喹諾酮類藥物大腸桿菌敏感性恢復的條件及機制。尋找耐藥細菌對藥物的敏感性恢復的方法，為降低或消除細菌耐藥性對人的健康和養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的危害提供幫助。

2、
　　1、將對環(huán)丙沙星、恩諾沙星、洛美沙星、諾氟沙星、氧氟沙星和萘啶酸等6種喹諾酮類藥物高度耐藥的4株野生型大腸桿菌（E1、E2、E4、E7），在無藥營養(yǎng)肉湯中進行傳代培養(yǎng)，每天傳代2次，連續(xù)傳代80天，共計傳代約480代，設(shè)3個重復；每5天測定一次6種藥物對傳代菌株的MIC值，觀察傳代對細菌耐藥水平變化的影響。結(jié)果表明：經(jīng)480代傳代后環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、洛美沙星和氧氟沙星對E1、E2、E4、E7的MIC值均有一定程度

3、的下降，但仍處于高度耐藥水平，其中對環(huán)丙沙星的MIC平均降幅最大（為4.8倍）；萘叮酸對4株菌的MIC值未發(fā)生變化。結(jié)論：對氟喹諾酮類藥物高度耐藥的野生型大腸桿菌在普通傳代條件下其敏感性難以恢復，尤其是萘叮酸，建議在已經(jīng)耐藥的養(yǎng)殖場中不再使用該藥。
　　2、無藥營養(yǎng)肉湯用生理鹽水稀釋8倍、16倍和32倍后，將4株野生型耐藥大腸桿菌分別在其中傳代培養(yǎng)，每天傳代2次，連續(xù)傳代60天，共計傳代約398代；每5天檢測環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾

4、氟沙星、洛美沙星和氧氟沙星對傳代菌株的MIC值，觀察營養(yǎng)匱乏因素對細菌耐藥水平變化的影響。結(jié)果表明：環(huán)丙沙星對四株耐藥大腸桿菌的平均MIC由傳代前的96μg/mL降低到了傳代后的7μg/mL，MIC值的降幅最大，敏感性恢復最為顯著；其次是諾氟沙星和氧氟沙星，分別由傳代前的64μg/mL和40μg/mL降低到了傳代后的11μg/mL和16μg/mL；而恩諾沙星和洛美沙星的敏感性雖有所恢復，但均未恢復至敏感或中介水平。結(jié)論：在不同的營養(yǎng)水平

5、條件下進行傳代培養(yǎng)，耐藥菌對不同氟喹諾酮類藥物的敏感性恢復存在差異，其中環(huán)丙沙星的敏感性最容易恢復，其次是諾氟沙星和氧氟沙星，耐藥菌對恩諾沙星和洛美沙星的敏感性難以恢復至敏感或中介水平。
　　3、對4株耐藥大腸桿菌與一株敏感大腸桿菌的菌液分別按7/3、5/5和3/7的比例混合后在無藥培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，共3個重復，每天傳代2次，連續(xù)傳代60天，共計約398代；每隔5天檢測上述五種氟喹諾酮類藥物對傳代菌株的MIC值，以觀察生存競爭因素

6、對細菌耐藥水平變化的影響。結(jié)果表明：5種藥物對混合培養(yǎng)菌群的MIC值均降低，環(huán)丙沙星、諾氟沙星較于恩諾沙星、洛美沙星、氧氟沙星更容易恢復至敏感或中介水平；并且混合培養(yǎng)菌液中敏感菌比例越高，其敏感性恢復越容易。結(jié)論：敏感細菌的競爭對耐藥菌群的敏感性恢復有重要的影響。
　　4、將對氟喹諾酮類藥物表現(xiàn)為敏感的野生型大腸桿菌 E685、E714、E746進行誘導耐藥后，得到相對應的耐藥菌株R685、R714、R746。將R685、R714

7、、R746中混入少量敏感菌后連續(xù)傳代培養(yǎng)，共3個重復，每天傳代2次，總共傳代240代，每隔5天測定五種氟喹諾酮類藥物對傳代菌株的MIC值，得到敏感性恢復的菌株C685、C714、C746。并測定和繪制E714、R714、C714菌株在普通營養(yǎng)肉湯中的生長曲線。結(jié)果：R685、R714、R746等3株誘導耐藥菌株中R714連續(xù)傳代后（即C714），5種藥物對其MIC值降低速度最快、降幅最大，在傳代150代后，恩諾沙星對C714的MIC值降

8、低到中介水平，其余四種藥物對C714的MIC則均降為敏感水平；而C685和C746對諾氟沙星、洛美沙星和氧氟沙星的MIC值降為敏感或中介水平，但對環(huán)丙沙星、恩諾沙星仍表現(xiàn)為耐藥。結(jié)論：與野生型高度耐藥大腸桿菌的敏感性恢復相比，短期誘導耐藥的菌株其敏感性更容易得到恢復。并且耐藥菌的生長速率較敏感菌低，細菌獲得耐藥性后可能會增加其生存適合度代價，而使其在無藥環(huán)境的生存競爭中處于劣勢。
　　5、應用 PCR方法對試驗菌傳代前后的PMQR

9、耐藥基因進行檢測，考察耐藥水平變化后耐藥基因的攜帶情況。結(jié)果：在普通條件下進行傳代培養(yǎng)，傳代前后的試驗菌內(nèi)PMQ R耐藥基因的表型未見變化,這與它們耐藥水平未發(fā)生變化相一致；在營養(yǎng)匱乏因子脅迫下傳代，E2、E4、E7出現(xiàn)qnrB和aac(6‘)-Ib-cr耐藥基因的丟失，與其敏感性得到恢復結(jié)果相一致；在不同的耐藥/敏感菌比例下傳代：E2、E7菌株qnrB耐藥基因丟失，E2、E4、E7菌株aac(6‘)-Ib-cr耐藥基因丟失，與其敏感性

10、得到恢復結(jié)果相一致。誘導耐藥菌株（R685、R714、R746）在耐藥菌/敏感菌比例為95/5的條件下傳代，C714出現(xiàn)qnrB、aac(6‘)-Ib-cr和qepA耐藥基因的丟失，C685出現(xiàn)qnrB耐藥基因的丟失，與其敏感性回復結(jié)果相一致。結(jié)論：qnrB、aac(6‘)-Ib-cr和qepA耐藥基因在耐藥大腸桿菌的傳代過程中容易發(fā)生丟失，它們的丟失與對耐藥菌的敏感性恢復起著重要的作用。
　　6、通過基因測序分析試驗菌株gyr