鉀離子—氯離子共轉(zhuǎn)運(yùn)體2(KCC2)與突觸可塑性的研究.pdf

1、爆發(fā)性(bursting)和節(jié)律性(rhythmic)發(fā)放的動(dòng)作電位是大腦中神經(jīng)信息處理的一個(gè)重要特征,受到GABAA受體所介導(dǎo)抑制作用的嚴(yán)格調(diào)控。這種抑制作用在調(diào)節(jié)谷氨酸能突觸可塑性和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸出中也起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn),增強(qiáng)GABAA受體介導(dǎo)的抑制作用,是麻醉藥損傷興奮性突觸傳遞長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)的一個(gè)重要原因,而且可能是全麻藥相關(guān)記憶損傷的基礎(chǔ)。同時(shí),K+-Cl--共轉(zhuǎn)運(yùn)體2(KCC2)通過控制細(xì)胞內(nèi)的氯離子濃度來調(diào)節(jié)(抑制性的)GA

2、BA能突觸效能。盡管病理?xiàng)l件下的研究已發(fā)現(xiàn)了多種活動(dòng)依賴的KCC2下調(diào)機(jī)制,但是生理過程中,KCC2在調(diào)節(jié)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的活動(dòng)和突觸可塑性中的潛在變化和作用仍不清楚。
　　有趣的是,在高級(jí)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)雖有大量的甘氨酸受體分布,卻沒有檢測(cè)到甘氨酸能突觸的存在。作為一個(gè)重要的配體門控的氯離子通道,它在高級(jí)中樞存在的意義和生理功能并不清楚。盡管沒有甘氨酸能突觸,突觸外的這些甘氨酸受體是否也能夠借助KCC2調(diào)控的胞內(nèi)氯離子穩(wěn)態(tài)的變化,進(jìn)一步參

3、與調(diào)節(jié)神經(jīng)環(huán)路的活動(dòng)呢? 通過聯(lián)合應(yīng)用急性制備的海馬腦片、培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元、電生理記錄、免疫印跡和免疫細(xì)胞化學(xué)等方法,我們研究了下面三個(gè)問題:1,KCC2是否參與LTP的表達(dá)以及LTP伴隨的EPSP-Spike耦聯(lián)增強(qiáng)? 2,KCC2水平的維持是不是麻醉藥(異丙酚)引起LTP損傷的重要原因? 3,在培養(yǎng)的海馬神經(jīng)環(huán)路中,KCC2決定的氯離子穩(wěn)態(tài)是否通過GABAAR和GlyR調(diào)節(jié)自發(fā)性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的活性? 主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1、在

4、大鼠海馬腦片，LTP伴隨的KCC2下調(diào)貢獻(xiàn)于EPSP-Spike耦聯(lián)增強(qiáng)為了研究KCC2在LTP形成中的可能變化與潛在作用，實(shí)驗(yàn)中我們聯(lián)合應(yīng)用了場(chǎng)電位記錄和免疫印跡的方法，分別檢測(cè)了突觸效能和KCC2蛋白量的變化情況。在急性制備的海馬腦片標(biāo)本上，我們發(fā)現(xiàn)，CA1區(qū)LTP的發(fā)生伴隨著KCC2的下調(diào)，而非LTD的表達(dá)。同時(shí)，在Schaffer側(cè)枝谷氨酸能突觸誘導(dǎo)LTP的過程中，CA3/DG區(qū)以及臨近皮層區(qū)的KCC2水平維持不變。應(yīng)用APV阻

5、斷NMDA受體不僅阻斷了LTP的誘導(dǎo)，同時(shí)阻止了KCC2的下調(diào)。而且，應(yīng)用furosemide抑制KCC2的功能直接誘導(dǎo)出了與LTF成分中一致的EPSP-Spike禍聯(lián)增強(qiáng)。這些結(jié)果提示了LTP形成中一個(gè)新的參與機(jī)制:KCC2的下調(diào)不僅貢獻(xiàn)于LTP時(shí)GABA能抑制效能的減弱，而且貢獻(xiàn)于LTP伴隨的EPSP-Spike增強(qiáng)。
　　2、在大鼠海馬腦片，全麻藥異丙酚誘導(dǎo)的LTP損傷中KCC2表達(dá)量與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活性的變化
　　為了研究

6、KCC2依賴的抑制效應(yīng)在麻醉藥誘導(dǎo)LTP損傷中的可能作用，我們應(yīng)用場(chǎng)電位記錄和免疫印跡的方法，在大鼠海馬腦片CA1區(qū)檢測(cè)了異丙酚對(duì)LTP表達(dá)和KCC2水平的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):異丙酚(30 }M)不僅損傷了LTP的表達(dá)，而且阻止了LTP伴隨的KCC2下調(diào)。該濃度的異丙酚對(duì)基礎(chǔ)的谷氨酸能突觸傳遞沒有影響，但是顯著增強(qiáng)了海馬腦片CA1區(qū)的GABA能突觸的回返性抑制效能。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，GABAA受體的阻斷劑picrotoxin完全消除了異丙酚

7、引起的上述效應(yīng)。因此，GABA能突觸抑制效能的增強(qiáng)和神經(jīng)元興奮性的抑制，可能是異丙酚導(dǎo)致的KCC2持續(xù)維持在較高水平(與基礎(chǔ)水平接近)以及LTP損傷的重要原因。該結(jié)果提示KCC2在LTP的表達(dá)中扮演著新的作用，同時(shí)暗示KCC2一依賴的GABA能抑制效能的維持可能是麻醉藥引起LTP損傷的分子基礎(chǔ)。
　　3、海馬自發(fā)性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)調(diào)控中，氯離子穩(wěn)態(tài)對(duì)GABAA受體和甘氨酸受體介導(dǎo)作用的差異性調(diào)節(jié)
　　為了闡明GABAA受體和甘氨

8、酸受體與KCC2-依賴的胞內(nèi)氯離子穩(wěn)態(tài)在調(diào)控自發(fā)性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)中的差別、相關(guān)性和潛在的功能意義，我們?cè)谂囵B(yǎng)的海馬神經(jīng)元上，應(yīng)用膜片鉗記錄的方法測(cè)量了相應(yīng)條件下自發(fā)的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)情況。結(jié)果顯示:與直接阻斷突觸內(nèi)GABAA受體(即阻斷GABA能的突觸傳遞)一致，KCC2的抑制顯著增強(qiáng)了神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的自發(fā)活性。隨后進(jìn)一步的給予荷包牡丹堿進(jìn)一步增強(qiáng)了furosemide在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中所引發(fā)的興奮效應(yīng);而furosemide不能改變荷包牡丹堿引起的效

9、應(yīng)。令人驚訝的是，阻斷甘氨酸受體不僅顯著降低了自發(fā)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)，同時(shí)誘導(dǎo)出明顯的toni。電流。而且，隨后抑制KCC2的功能并不能改變士的寧對(duì)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的抑制作用。另一方面，在furosemide抑制KCC2功能增強(qiáng)自發(fā)性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)后，給予士的寧仍然能夠顯著的減低神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的自發(fā)性突觸活動(dòng)，同時(shí)伴有明顯的tonic電流。這些結(jié)果提示，KCC2-依賴的氯離子穩(wěn)態(tài)主要通過GABAA受體介導(dǎo)的突觸抑制來調(diào)節(jié)自發(fā)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)，而不是通過甘氨酸