豬瘟RT-PCR ELISA試劑盒的研制.pdf

1、本研究結(jié)合了標(biāo)記地高辛的RT-PCR技術(shù)和生物素標(biāo)記的探針雜交技術(shù)，成功建立了一種檢測(cè)豬瘟病原的RT-PCRELISA方法，組裝了試劑盒，并進(jìn)行了初步應(yīng)用。 從5'-UTR(Un-translatedregion)區(qū)域設(shè)計(jì)了特異性的引物和捕獲探針，在PCR過(guò)程中加入了地高辛標(biāo)記，將探針作生物素標(biāo)記。利用鏈親和素包被的ELISA酶標(biāo)板與生物素標(biāo)記的探針特異性結(jié)合，而探針又特異性地與標(biāo)記了地高辛的PCR產(chǎn)物相結(jié)合，最后采用抗地高辛的

2、辣根過(guò)氧化物酶與ABTS進(jìn)行顯色。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中成功摸索了RT-PCRELISA過(guò)程的各項(xiàng)條件，確定了最佳的工作濃度與溫度以及反應(yīng)時(shí)間。本研究結(jié)果表明：鏈親和素的最佳包被濃度為1ug/ml，探針的最佳濃度為50ng/ml，PCR產(chǎn)物的濃度為每孔10ul，抗地高辛辣根過(guò)氧化物酶的稀釋濃度為1∶3000，最佳的雜交溫度為50℃，最佳的雜交時(shí)間為30-60分鐘。 對(duì)試劑盒內(nèi)試劑的保存作了防腐劑選擇實(shí)驗(yàn)和保存期試驗(yàn)，結(jié)果表明在試劑盒保存了1

3、0個(gè)月以后，陰陽(yáng)性對(duì)照仍然成立。在防腐劑疊氮鈉和柳硫汞酸鈉的選擇實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)疊氮鈉對(duì)酶有一定影響，大大降低了實(shí)驗(yàn)OD值，因此選擇柳硫汞酸鈉作為試劑盒的防腐劑。采用本實(shí)驗(yàn)建立的試劑盒對(duì)來(lái)自北京三個(gè)豬場(chǎng)50頭份病料進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有36頭份為陽(yáng)性，14頭份為陰性。 本研究建立了一種快速、敏感、特異的豬瘟RT-PCRELISA方法，為我國(guó)豬瘟的診斷、監(jiān)測(cè)和調(diào)查提供了良好的新型技術(shù)手段，為保障北京市和我國(guó)的安全豬肉生產(chǎn)奠定了扎實(shí)的基礎(chǔ)