磺胺類藥物殘留ELISA快速檢測(cè)試劑盒的研制.pdf

1、本研究通過單克隆抗體的純化，直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法的確立，樣品提取方法的優(yōu)化，直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立，動(dòng)物試驗(yàn)以及與國外同類試劑盒和儀器方法的比較，建立了檢測(cè)食源性動(dòng)物產(chǎn)品中磺胺嘧啶和磺胺類藥物殘留的兩種ELISA檢測(cè)方法，并在此基礎(chǔ)上相應(yīng)地研制出兩個(gè)快速檢測(cè)試劑盒。研究結(jié)果如下： 1、利用本實(shí)驗(yàn)室已有的抗磺胺嘧啶單克隆抗體細(xì)胞株（SD-4）經(jīng)復(fù)蘇、篩選、生產(chǎn)、純化得到抗磺胺嘧啶單克隆抗體。用重氮化一偶聯(lián)法將磺胺嘧啶（

2、SD）與卵清白蛋白（OVA）按投料摩爾比2：1連接制備了包被抗原（SD-OVA），用過碘酸鈉法將SD-OVA與辣根過氧化物酶（HRP）按投料摩爾比1：2連接制備了酶標(biāo)抗原（SD-OVA-HRP）。藥物競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)確定了直接競(jìng)爭(zhēng)ELLSA方法；將常規(guī)包被與微波包被法從方法的靈敏度、包被時(shí)間、包被穩(wěn)定性進(jìn)行比較，確立微波包被法。直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA試驗(yàn)在1ng／mL～729 ng／mI濃度范圍建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y＝12.05x+2.2538，線性相

3、關(guān)系數(shù)R<'2>＝0.995， IC<,50>為41.7ng／mL。與磺胺間甲氧嘧啶（SMM）、磺胺對(duì)甲氧嘧啶（SMD）、磺胺二甲氧嘧啶（SDM）、磺胺二甲嘧啶（SM<,2>）、磺胺喹嗯啉（SQ）及磺胺甲噁唑（SMZ）的交叉反應(yīng)率分別為：1.7％、3.1％、＜0.01％、＜0.01％、＜0.01％、3.4％。建立了豬肉、雞肉、雞肝、雞蛋、牛奶中SD提取方法，進(jìn)而研制出SD酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，在豬肉、雞肉、雞肝中定量限為20μg／kg，

4、回收率70％～110％，批間變異系數(shù)＜26％；在雞蛋、牛奶定量限為5μg／kg，回收率60％-120％，批問變異系數(shù)＜32％。與同類試劑盒比較，結(jié)果表明自制試劑盒與英國試劑盒準(zhǔn)確度、精密度水平相當(dāng)，靈敏度低于英國試劑盒。飼喂仔肉雞含500mg／kg SD飼料7d，停藥后連續(xù)檢測(cè)5d，自制試劑盒測(cè)定雞肉中SD殘留量與高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定結(jié)果相近。同時(shí)，飼喂蛋雞含400 mg／kg SD飼料5d，停藥7d連續(xù)檢測(cè)，自制試劑盒與國外

5、試劑盒測(cè)定結(jié)果相符合。 以上結(jié)果表明，本研究研制的試劑盒能夠滿足豬肉、雞肉、雞肝、雞蛋、牛奶中SD殘留檢測(cè)要求，試劑盒研制工作基本完成。 2、利用本實(shí)驗(yàn)室已有的抗磺胺類藥物單克隆抗體的細(xì)胞株（SDL-4）采取與SD-4株細(xì)胞相同步驟得到抗磺胺類藥物單克隆抗體。采用混合酸酐法將本實(shí)驗(yàn)室合成的磺胺類藥物母核結(jié)構(gòu)藥物（SDL）與人血清白蛋白（HSA）按投料摩爾比2：1連接制備了包被抗原SDL-HSA，用過碘酸鈉法將SDL-HS

6、A與辣根過氧化物酶（HRP）按1：2連接制備了酶標(biāo)抗原（SDL-HSA-HRP）直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法10ng／mL～2430ng／mL范圍建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y＝14.571x+2.2619，R<'2>＝0.987，ICs0為153.0 ng／mL，與SMM、SMD、SQ、SDM、SD、SM2、SMZ、磺胺甲氧嗪（SMP）和三甲氧芐氨嘧啶（TMP）的交叉反應(yīng)率分別為：166.8％、100％、105％、38.7％、11.9％、4.9％、＜0