三聚氰胺ELISA快速檢測試劑盒的研制.pdf

1、食品安全問題已引起全球的高度關(guān)注。在我國，三聚氰胺（MEL）已被列入生乳收購及乳制品產(chǎn)品出廠必檢項(xiàng)目。三聚氰胺是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化工中間體，因具價格低廉，廣泛使用在建筑材料和油漆中，不法商人因其分子中氮含量較高，而違法添加到食品中，增加含氮量。三聚氰胺違法添加到奶制品中，嚴(yán)重?fù)p害了人們的健康。目前，酶聯(lián)免疫檢測法(ELISA)簡便、快速，適合大規(guī)模樣品篩選，但國內(nèi)檢測三聚氰胺的ELISA試劑盒主要依靠價格高昂的國外試劑盒，嚴(yán)重制約

2、著ELISA法的推廣。研制具有自主產(chǎn)權(quán)的快速檢測三聚氰胺ELISA試劑盒，已成為監(jiān)測MEL非法使用的當(dāng)務(wù)之急。
　　本研究在分析三聚氰胺分子結(jié)構(gòu)和免疫原性的基礎(chǔ)上，通過兩種不同的方法：一是改造三聚氰胺結(jié)構(gòu)類似物合成羧基化MEL半抗原，半抗原與載體蛋白偶聯(lián)合成三聚氰胺人工抗原。二是由于三聚氰胺本身攜帶的氨基可直接與載體蛋白偶聯(lián)合成三聚氰胺人工抗原。將合成用免疫原進(jìn)行紫外和抗原抗體競爭結(jié)合鑒定，將偶聯(lián)比高的免疫原免疫兔子，獲得抗三聚氰

3、胺血清，將抗三聚氰胺血清進(jìn)行鑒定純化后，用于直接ELISA并對其條件進(jìn)行優(yōu)化，從而建立直接ELISA快速檢測三聚氰胺的方法，研制試劑盒并進(jìn)行試劑盒驗(yàn)證，主要研究結(jié)果如下：
　　1.免疫原采用多種化學(xué)方法進(jìn)行合成。將原料2-氯-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪合成羧基化MEA，采用活性酯法和氯甲酸異丁酯法偶聯(lián)羧基化MEA獲得免疫原（MEA-BSA）和包被原（MEA-OVA）。利用三聚氰胺氨基采用戊二醛法直接與BSA合成人工抗原（ME

4、L-BSA1和MEL-BSA2）。經(jīng)測定簡單EDC法的半抗原與載體蛋白MEL-BSA偶聯(lián)比為29.35:1。戊二醛法制備的三聚氰胺人工免疫原的偶聯(lián)比為：MEL-BSA1為7.25:1；MEL-BSA2為9.06:1；改造后合成的三聚氰胺人工免疫原的偶聯(lián)比:MEA-BSA為29.63:1。
　　2.用免疫原(MEA-BSA)免疫動物，第5次免疫后用間接ELISA法初步測定兔子抗血清效價為1:2000，抗血清IC50值為45.92ng