基于原子力顯微鏡技術在單細胞水平研究殼聚糖-膠原的細胞相容性.pdf

1、細胞膜表面的粘附受體分子對細胞感知和集成細胞周圍微環(huán)境所提供的信號,例如基底表面物理化學性質和基底硬度等至關重要，細胞將所感知的化學信號或力信號轉化為相應的生物信號，進而調節(jié)細胞粘附、鋪展、增殖和分化等生理過程。定量地檢測細胞與生物材料基底間相互作用，了解基底對細胞生理行為的影響，不僅對揭示細胞生理行為變化的本質具有十分重要的意義，同時也可以為生物材料的設計提供重要的實驗依據。近年來，隨著原子力顯微鏡（AFM）技術在生物學方面應用的不斷

2、拓展，能夠在單細胞水平上揭示生物材料與細胞間的相互作用，為定量研究細胞的生理變化和生物材料的設計提供了重要的微觀信息和實驗依據。因此，本文以AFM單細胞力譜技術為主要技術手段，殼聚糖和膠原為研究模型，在單細胞水平上評價殼聚糖/膠原基底的細胞相容性及其作用機制，主要從以下三個方面展開研究：
　　1、目前，AFM用于檢測細胞楊氏模量的技術還不是十分成熟，許多操作參數需要深入研究，以獲得準確的實驗結果。首先，我們通過AFM納米操作技術，

3、將直徑為5μm的二氧化硅微球修飾在無針尖的AFM探針懸臂上，用于檢測細胞和基底的力學性能。這一以AFM納米操作技術為基礎的探針修飾方法的成功為進一步將活細胞固定于AFM探針上，建立AFM單細胞力譜技術奠定了基礎。同時，我們系統(tǒng)地研究了在細胞楊氏模量測量過程中，AFM施加的探針壓痕力和加載速度以及探針形狀對細胞楊氏模量測量結果的影響，為AFM測量細胞楊氏模量的參數選擇提供了重要的實驗依據。此外，我們通過AFM檢測在相同基底上培養(yǎng)的不同細胞

4、，結果發(fā)現不同的細胞展現出不同的楊氏模量，證實AFM可以作為一種用于疾病診斷或細胞生理狀態(tài)表征的新方法。
　　2、基于AFM研究不同組分殼聚糖-膠原膜對細胞粘附、形貌和力學性能的影響。利用AFM單細胞力譜技術，定量檢測了細胞與不同基底間的相互作用力。實驗結果顯示，隨著膜中膠原含量的增加，細胞的粘附力從0.76±017 nN增加到1.70±0.19 nN，細胞的楊氏模量從11.94±3.19 kPa減小至1.81±0.52 kPa；

5、細胞鋪展面積和增殖速率逐漸增加，細胞高度逐漸降低，偽足融合，細胞邊緣變平滑。結果表明在基底上較大的細胞粘附力和較小的細胞楊氏模量會促進細胞的粘附、鋪展，使細胞在不同膜上展出明顯的形貌差異；實驗結果也得到了細胞光學顯微鏡周長及面積統(tǒng)計和CCK-8實驗的佐證。這一研究為生物材料的設計和殼聚糖-膠原基細胞靶向藥物載體的設計提供了實驗依據和理論指導。
　　3、基于 AFM力譜技術，通過制備不同硬度的殼聚糖膜，研究基底硬度對細胞粘附和鋪展的

6、影響。首先，將MC3T3-E1細胞修飾在無針尖的AFM探針上，檢測細胞與不同硬度基底間的粘附力，實驗結果表明，細胞的粘附力隨著基底硬度的增加而增加，在較軟的殼聚糖膜上細胞的粘附力最小，為0.53±0.08 nN，在較硬的殼聚糖膜上，細胞的粘附力最大為1.19±0.14 nN；進一步對不同硬度膜上細胞的楊氏模量統(tǒng)計結果顯示，隨著基底硬度的增加，細胞楊氏模量從12.6±2.3 kPa減小到3.6±1.5 kPa；在相同硬度的殼聚糖膜上，吸附

7、膠原后，細胞的粘附力發(fā)生了相應的增加，細胞楊氏模量發(fā)生降低，證實膠原可以增強材料的細胞親和力。此外，細胞鋪展面積和細胞AFM微觀形貌的檢測結果表明，隨著基底硬度的增加，細胞的鋪展面積增加，細胞偽足逐漸融合；CCK-8實驗證實基底硬度的增加促進了MC3T3-E1細胞的增殖和粘附。我們的實驗在單細胞水平上，證實細胞粘附力和楊氏模量的變化是基底硬度對細胞粘附、鋪展影響的主要因素，同時也證實基底的微觀硬度也是影響材料細胞相容性的主要因素，這為復