PICK1：缺血性腦損傷治療的新靶點(diǎn).pdf

1、缺血性神經(jīng)損傷的機(jī)制研究中，興奮性氨基酸細(xì)胞毒性扮演了重要角色并且是重要的治療中風(fēng)的研究方向之一。以往研究往往更加關(guān)注NMDA受體在其中的重要作用，而另一種谷氨酸受體AMPA受體(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazoleproprionic acid receptor)在缺血中的作用如今已經(jīng)受到日益廣泛的關(guān)注。AMPA受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛分布，由GluR1-4四個(gè)亞基組成。大量研究表明，缺乏Glu

2、R2的AMPA受體能通透包括鈣離子在內(nèi)的多種二價(jià)陽離子，參與了多種病理過程的神經(jīng)損傷。
　　 酸敏感離子通道(acid-sensing ion channel，ASIC)是一類由胞外酸化所激活的陽離子通道，屬于Degenerin/epithelial Na+channel(DEG/ENaC)家族成員。ASIC廣泛存在于哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)。ASIC在神經(jīng)可塑性和疾病發(fā)生中表現(xiàn)出重要的作用?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)四種基因編碼的6種

3、ASIC亞基。其中，ASIC1a主要通透Na+，對Ca2+也有一定的通透性，它可以被乳酸積累和組織酸化所激活，參與了缺血性腦損傷的病理進(jìn)程。
　　 近年來分子生物學(xué)的部分研究表明，一種含有PDZ和BAR結(jié)構(gòu)域的膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白PICK1（protein interacts with C kinase1）在AMPA受體的上膜、轉(zhuǎn)運(yùn)和ASIC的膜定位分布過程中扮演了極為重要的關(guān)鍵角色。研究表明，PICK1蛋白和AMPA受體的相互作用介

4、導(dǎo)了AMPA受體GluR2亞基的內(nèi)化和循環(huán)，從而影響到鈣信號相關(guān)的突觸功能如LTP和LTD。PICK1蛋白和ASICs分布有高度的一致性，并可影響ASICs膜定位?？紤]到缺血缺氧后鈣通透性的AMPA受體在突觸后膜定位的增加以及PICK1對于AMPA受體及ASIC膜分布的調(diào)節(jié)作用，我們推測PICK1可能在缺血性腦損傷過程中扮演了重要角色。最新研究報(bào)道認(rèn)為PICK1介導(dǎo)了OGD-R引起的海馬神經(jīng)細(xì)胞興奮性氨基酸損傷。本研究探索了PICK1在

5、缺血性腦損傷中的作用。
　　 第一部分：PICK1對局灶性腦缺血中鈣通透性AMPA受體表達(dá)及分布的影響
　　 目的：研究PICK1對局灶性腦缺血中鈣通透性AMPA受體表達(dá)及分布的影響。
　　 方法：用大腦中動脈栓塞（MCAO）的方法建立局灶性腦缺血模型，采用免疫印跡的方法檢測AMPA受體的變化和膜表達(dá)的變化。用PICK1基因敲除研究PICK1對缺血引起AMPA受體表達(dá)及分布的變化的影響。
　　 結(jié)果：缺血

6、再灌注損傷后3小時(shí)，與假手術(shù)組相比，皮質(zhì)和海馬GluR2亞基的表達(dá)均尚未發(fā)生改變。膜蛋白提取和Western Blotting檢測表明，在缺血再灌注損傷后3小時(shí)，與假手術(shù)組相比，模型組皮質(zhì)和海馬GluR2的膜表達(dá)減少。通過免疫共沉淀的方法檢測缺血對PICK1與GluR2之間的蛋白質(zhì)相互作用的影響。與假手術(shù)組相比，缺血導(dǎo)致了皮質(zhì)和海馬的PICK1和GluR2的結(jié)合增加。免疫熒光的結(jié)果類似。進(jìn)一步用PICK1敲除小鼠研究缺血對AMPA受體G

7、luR2亞基表達(dá)、膜表達(dá)的影響。研究表明，在PICK1敲除的小鼠上GluR2的膜表達(dá)與同窩生的野生型小鼠相比無顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這表明PICK1敲除對GluR2的膜表達(dá)并沒有明顯的影響。而對野生型和敲除鼠同時(shí)給予MCAO模型處理后可以觀察到和大鼠類似的變化，即GluR2的膜表達(dá)降低。而敲除鼠GluR2下降的程度和野生型相比，明顯減輕。
　　 結(jié)論：缺血引起AMPA受體GluR2亞基膜表達(dá)的減少；PICK1參與這種膜轉(zhuǎn)運(yùn)的過程，P

8、ICK1敲除能減弱缺血引起的AMPA受體GluR2亞基膜表達(dá)的減少。
　　 第二部分：PICK1對局灶性腦缺血中ASIC1表達(dá)和分布的影響
　　 目的：研究局灶性腦缺血中ASIC1表達(dá)和分布的影響以及PICK1的影響。
　　 方法：用大腦中動脈栓塞（MCAO）的方法建立局灶性腦缺血模型，觀察ASIC1a在局灶性腦缺血損傷中的表達(dá)變化。用PICK1基因敲除研究PICK1在其中的作用。
　　 結(jié)果：與假手術(shù)組

9、動物同側(cè)相比，模型組大鼠右側(cè)（缺血側(cè)）的皮質(zhì)ASIC1a表達(dá)在缺血再灌注損傷后開始上升，在3小時(shí)達(dá)到頂峰，隨后開始下降，24小時(shí)仍略高于假手術(shù)組，72小時(shí)恢復(fù)到正常的水平。通過免疫共沉淀的方法檢測缺血對PICK1與ASICs之間的蛋白質(zhì)相互作用的影響。在缺血再灌注的大鼠皮質(zhì)組織上，與假手術(shù)組相比，等量PICK1結(jié)合的ASIC1a量有所增加。為進(jìn)一步研究PICK1在其中的作用，我們利用PICK1基因敲除鼠研究ASIC1a在缺血后的膜表達(dá)變

10、化?？梢钥吹?，在普通野生型小鼠上，缺血會導(dǎo)致ASIC1a的膜表達(dá)升高。而同窩生PICK1敲除鼠同時(shí)給與缺血再灌注損傷模型處理后，與野生型小鼠相比，ASIC的膜表達(dá)也發(fā)生了升高，但其上升的幅度較小。
　　 結(jié)論：缺血能夠引起ASIC1a的膜表達(dá)的上調(diào)，PICK1參與這種膜表達(dá)的變化，PICK1敲除能夠減輕缺血引起的ASIC1a的膜表達(dá)的增加。
　　 第三部分：PICK1對OGD-R所致神經(jīng)元損傷的作用
　　 目的：

11、細(xì)胞水平研究PICK1對OGD-R所致神經(jīng)元損傷的作用
　　 方法：體外建立氧糖剝奪再灌注模型。敲除PICK1基因和過表達(dá)PICK1基因觀察OGD-R所致神經(jīng)元損傷的變化結(jié)果：ODR-R引起細(xì)胞活性的下降過程中，PICK1敲除的雜合子（PICK1+/-mice）神經(jīng)元和 PICK1敲除純合子（PICK1-/-mice）神經(jīng)元的活性下降都顯著小于同窩生野生型小鼠的活性下降。在ODR-Rep對細(xì)胞LDH釋放的影響實(shí)驗(yàn)中，PICK1敲

12、除雜合子和純合子神經(jīng)元的LDH釋放都顯著小于野生型小鼠的LDH釋放。PICK1敲除可以顯著降低OGD-R引起的凋亡蛋白表達(dá)。過表達(dá)PICK1蛋白則會增加OGD-R引起的神經(jīng)細(xì)胞株損傷。轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的SH-SY5Y細(xì)胞株OGD-R處理后，經(jīng)IPP軟件分析神經(jīng)細(xì)胞死亡比例約為40%；轉(zhuǎn)染PICK1質(zhì)粒的SH-SY5Y細(xì)胞株OGD-R處理后，經(jīng)IPP軟件分析神經(jīng)細(xì)胞死亡比例約為60%，明顯加重OGD-R引起的神經(jīng)細(xì)胞死亡。
　　 結(jié)論：

13、PICK1在OGD-R所致神經(jīng)元損傷其重要作用，PICK1敲除可以顯著降低OGD-R引起的細(xì)胞凋亡。過表達(dá)PICK1蛋白則會增加OGD-R引起的神經(jīng)細(xì)胞株損傷。
　　 第四部分 PICK1敲除對局灶性腦缺血損傷的保護(hù)作用
　　 目的：在整體水平研究PICK1敲除是否對局灶性腦缺血損傷有保護(hù)作用
　　 方法：取模型組和假手術(shù)組的大鼠右側(cè)（缺血側(cè)）的皮質(zhì)和海馬，提取蛋白，通過免疫印跡法觀察PICK1在局灶性腦缺血再灌

14、注損傷后的不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)變化的情況。
　　 結(jié)果：與假手術(shù)組動物同側(cè)相比，模型組大鼠右側(cè)（缺血側(cè)）的皮質(zhì)PICK1表達(dá)在缺血再灌注損傷后開始上升，在3小時(shí)達(dá)到頂峰，隨后開始下降，72小時(shí)恢復(fù)到正常的水平（n=3）。而在海馬觀察到類似的結(jié)果。與假手術(shù)組動物同側(cè)相比，模型組大鼠右側(cè)（缺血側(cè)）的海馬PICK1表達(dá)在缺血再灌注損傷后開始上升，但在0小時(shí)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在3小時(shí)上升達(dá)到頂峰，隨后開始下降，72小時(shí)恢復(fù)到正常的水平。免疫組化的

15、結(jié)果也顯示一致的結(jié)果：在缺血再灌注后的3小時(shí)，PICK1的表達(dá)在海馬和皮質(zhì)顯著上升，在72小時(shí)恢復(fù)到正常水平。無論是對缺血24h損傷還是缺血（1 h）再灌注（24 h）損傷，PICK1敲除小鼠都表現(xiàn)出較好的耐受性，和野生型小鼠相比，梗死面積明顯減少。其中，缺血（24h）后PICK1敲除雜合子小鼠的梗死面積 (64.28±4.30 mm3)和 PICK1敲除純合子小鼠的梗死面積(42.14±4.13 mm3)都顯著小于同窩生野生型小鼠的梗