華南地區(qū)水稻橙葉病調(diào)查及其病原分子檢測體系的建立.pdf

1、水稻橙葉?。≧ice Orange Leaf Disease，ROLD）是一種由植原體（Phytoplasma）引起的病害，上世紀(jì)80年代末至90年代初，該病曾在華南局部地區(qū)流行成災(zāi)，對水稻生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害，此后的十多年里未見其嚴(yán)重發(fā)生的報(bào)道。早期研究認(rèn)為，該病僅由電光葉蟬（Inazuma dorsalis）傳播，但本研究室近年發(fā)現(xiàn)，可能因病菌變異，該病也可經(jīng)黑尾葉蟬（Nephotettix cinticeps）高效傳播。由于病害獲得了

2、新介體的傳播能力，監(jiān)測其發(fā)生流行動(dòng)態(tài)并建立病菌快速檢測技術(shù)十分必要。為此，本研究對華南地區(qū)進(jìn)行了廣泛的田間調(diào)查，明確了該病的分布與發(fā)生現(xiàn)狀；采用深度測序的方法獲得了病菌近全長基因組序列；以水稻橙葉植原體侵染必需的細(xì)胞分裂蛋白基因序列為靶標(biāo)，開發(fā)了病菌特異 PCR檢測技術(shù)；同時(shí)建立了同步檢測水稻植株及單頭葉蟬體內(nèi)水稻橙葉植原體和水稻瘤矮病毒的雙重一步RT-PCR檢測方法。主要結(jié)果如下：
　　1、明確了華南地區(qū)水稻橙葉病分布區(qū)域及發(fā)生

3、現(xiàn)狀。2015年早稻、晚稻及2016年早稻生長期間，對華南稻區(qū)進(jìn)行了廣泛的田間調(diào)查，結(jié)果顯示，水稻橙葉病發(fā)生區(qū)域明顯擴(kuò)大，除老病區(qū)粵西南和桂東南外，在粵西、粵北、珠三角地區(qū)及海南中部均發(fā)現(xiàn)該病，部分地區(qū)發(fā)生偏重，以粵西南的羅定市受害最重。結(jié)合對田間傳病介體，尤其是新介體黑尾葉蟬發(fā)生情況的調(diào)查，推測水稻橙葉病極有可能我國南部稻區(qū)存在流行成災(zāi)的高風(fēng)險(xiǎn)。
　　2、獲得了水稻橙葉植原體基因組近全長核苷酸序列。以基于病菌16S rDNA序列

4、設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行半定量巢式 PCR檢測，結(jié)果表明，分蘗期水稻病株完全現(xiàn)癥葉片的葉鞘組織病菌含量最高，其次為病葉主脈，再次為葉片組織。采集完全顯癥葉片葉鞘組織，抽提總DNA，經(jīng)超聲波處理隨機(jī)打斷后，采用illumina HiseqTM2000測序平臺(tái)對總DNA進(jìn)行深度測序，獲得6.525G Clean reads，以洋蔥黃化植原體全基因組為參考序列，利用生物信息學(xué)軟件篩選并組裝為60條平均長度為9389nt的Contigs，最終獲得了長度約

5、607385bp的水稻橙葉植原體框架序列，推測該框架序列占基因組全長70％以上。
　　3、建立了水稻橙葉病PCR檢測方法與同步檢測水稻橙葉植原體和水稻廇矮病毒的雙重一步RT-PCR方法。選取水稻橙葉病植原體侵染必需的細(xì)胞分裂蛋白基因，設(shè)計(jì)引物建立ROLP的PCR檢測方法，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為492bp，可經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳清晰判別，檢測靈敏度為10-3每100mg病葉組織總DNA提取物與10-1單頭介體葉蟬總DNA提取物。水稻橙葉病和瘤矮